Три фракції днк еукаріотів, їх локалізація в хромосомах та функції. Хроматин: визначення, будова та роль у розподілі клітин

У препараті хроматину частку ДНК припадає зазвичай 30-40%. Ця ДНК є дволанцюжковою спіральною молекулою. ДНК еукаріотичних клітин гетерогенна за складом, містить кілька класів послідовностей нуклеотидів: послідовності, що часто повторюються (>106 разів), що входять у фракцію сателітної ДНК і не транскрибуються; фракція помірно повторюваних послідовностей (102-105), що становлять блоки істинних генів, а також короткі послідовності, розкидані по всьому геному; фракція унікальних послідовностей, що несе інформацію для більшості клітин білків.

Хроматин

До складу хроматину входить ДНК у комплексі з білком. В інтерфазних клітинах хроматин може рівномірно заповнювати обсяг ядра або розташовуватися окремими згустками (хромоцентри). Часто він особливо чітко виявляється на периферії ядра (пристінковий, примембранний хроматин) або утворює всередині ядра переплетення досить товстих (близько 0.3 мкм) і довгих тяжів, що утворюють подібність до внутрішньоядерного ланцюга.

В інтерфазі в зоні ядерного організатора утворюється ядерце. Еухроматин – це деконденсовані, деспіралізовані ділянки ДНК, з яких зчитується генетична інформація про амінокислотний склад білка (транскрипція). Еухроматин - функціонально активна частинахромосоми.

Гетерохроматин – це конденсовані, спіралізовані ділянки ДНК. Гетерохроматин – функціонально неактивні частини хромосоми. Гетерохроматин інтенсивно забарвлюється основними барвниками, тоді як еухроматин не має цієї властивості і виглядає у вигляді світлих, незабарвлених ділянок серед глибок гетерохроматину.

Хроматин інтерфазних ядер є несучими ДНК тільця (хромосоми), які втрачають у цей час свою компактну форму, розпушуються, деконденсуються. Ступінь такої деконденсації хромосом може бути різним у ядрах різних клітин. Коли хромосома або її ділянка повністю деконденсована, тоді ці зони називають дифузним хроматином. При неповному розпушенні хромосом в інтерфазному ядрі видно ділянки конденсованого хроматину (іноді званого гетерохроматин). Чим більш дифузний хроматин інтерфазного ядра, тим вище синтетичні процеси. Максимально конденсований хроматин під час мітотичного поділу клітин, коли він виявляється у вигляді щільних тілець – хромосом.

у робочому, частково або повністю деконденсованому, коли за їх участю в інтерфазному ядрі відбуваються процеси транскрипції та редуплікації;

у неактивному – у стані метаболічного спокою при максимальній їх конденсованості, коли вони виконують функцію розподілу та переносячи генетичного матеріалу до дочірніх клітин.

У хімічному відношенні препарати хроматину є складними комплексами дезоксирибонуклеопротеїдів, до складу яких входить ДНК і спеціальні хромосомні білки - гістони.

Білки хроматину

До них відносяться гістони та негістонові білки.

Гістони – сильноосновні білки. Їх лужність пов'язана з їхньою збагаченістю основними амінокислотами (головним чином лізином та аргініном). Ці білки не містять триптофану. Препарат сумарних гістонів можна розділити на 5 фракцій:

Н1 (від англійської histone) - багатий лізином гістон,

Н2а - помірно багатий на лізин гістон, Н2б - помірно багатий на лізин гістон,

Н4 - багатий аргініном гістон, Н3 - багатий аргініном гістон,

Гістони синтезуються на полісомах у цитоплазмі, цей синтез починається дещо раніше від редуплікації ДНК. Синтезовані гістони мігрують з цитоплазми в ядро, де зв'язуються з ділянками ДНК.

Негістонові білки – найбільш погано охарактеризована фракція хроматину.

Ямдрішки

Ділянки хромосом, у яких відбувається синтез рибосомних рибонуклеїнових кислот (рРНК). Знаходяться всередині ядра клітини і не мають власної мембранної оболонки, проте добре помітні під світловим та електронним мікроскопом].

Основною функцією ядерця є синтез рибосомних РНК та рибосом, на яких у цитоплазмі здійснюється синтез поліпептидних ланцюгів. У геном клітини є спеціальні ділянки, так звані ядерцеві організатори, що містять гени рибосомної РНК (рРНК), навколо яких і формуються ядерця. У ядерці відбувається синтез рРНК РНК полімеразою I, її дозрівання, збирання рибосомних субодиниць. У ядерці локалізуються білки, що беруть участь у цих процесах. Деякі з цих білків мають спеціальну послідовність - сигнал ядерцевої локалізації. Електронна мікроскопія дозволяє виділити в ядерці два основних компоненти: гранулярний (по периферії) - дозрівають субодиниці рибосом і фібрилярний (в центрі) - рибонуклеопротеїдні тяжі попередників рибосом.

Гранулярний компонент представлений зернами (діаметр 10-20 нм), що складаються з рибонуклеопротеїдних частинок (субодиниці рибосом). Фібрилярна частина складається з щільних тонких електроннощільних ниток (діаметр 5-8 нм), що утворюють компактну масу. Ці волокна концентруються навколо світліших серцевини з менш щільного матеріалу(Фібрилярні центри). Вважається, що фібрилярний матеріал є РНК (рибосомальна РНК), а фібрилярні центри складаються з ДНК і за будовою відповідають зернам хроматину.

Аморфний компонент забарвлюється блідо і містить ділянки розташування ядерцевих організаторів зі специфічними РНК-зв'язуючими білками і великими петлями ДНК, що беруть активну участь у транскрипції рибосомальної РНК-Фібрилярний і гранулярний компоненти утворюють ядерцеву нитку (нуклеонем0).

Основною функцією ядерця є синтез рибосом. У геном клітини є спеціальні ділянки, так звані ядерцеві організатори, що містять гени рибосомної РНК (рРНК), навколо яких і формуються ядерця. У ядерці відбувається синтез рРНК РНК полімеразою I, її дозрівання, збирання рибосомних субчастинок. У ядерці локалізуються білки, що у цих процесах.

Видалення гістону H1 з транскрипційно активного хроматину. 1*2*. У ранніх дослідахДж. Боннера (США) було показано, що ДНК у складі хроматину є набагато гіршою матрицею, ніж вільна ДНК. На підставі цих спостережень було висловлено припущення, що гістон є репресорами транскрипції.

Л. Н. Ананьєва та Ю. В. Козлову нашій лабораторії поставили завданням з'ясувати, чи мають інгібуючу дію всі гістони або тільки деякі з них. Для цього з хроматину клітин асцитного раку Ерліха мишей видаляли гістони екстракцією розчинами NaCl з концентрацією, що поступово підвищується. Отримані препарати були матрицею для синтезу РНК. Транскрипцію вели в присутності РНК-полімерази з кишкової палички, E. coli, яку брали надлишку, і суміші нуклеозидтрифосфатів. В інтервалі 0,4-0,6 М NaCl відбувалася різка деконденсація матеріалу, що виражається в набуханні ядерного гелю і навіть розчинення ДНП (якщо далі вести механічну обробку). При цьому, як було показано, вибірково видаляли гістон HI. Поруч із деконденсацією хроматину відбувалося різке посилення його матричної активності (рис. 26). Подальше збільшення концентрації солей в розчині, що екстрагує, вело до видалення інших гістонів і деякого, але не занадто вираженого додаткового збільшення матричної активності.

0 t. Тим самим гібридизованість виявляє відсотковий вміст у синтезованій РНК повторюваних послідовностей (за результатами, отриманими Л. Н. Ананьєвою, Ю. В. Козловим та автором); б - основні параметри синтезу РНК на різних матрицях: вільної ДНК, вихідному хроматині (ДНП 0) та хроматині, з якого видалений гістон H1 екстракцією 0,6 М NaCl (ДНП 0,6). Синтез РНК вели за допомогою РНК-полімерази кишкової палички у присутності мічених нуклеозидтрифосфатів: [ 14 C]-ATP і або [γ-32 P]-ATP, або [γ-32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP включалася на всю РНК, a [γ- 32 P] - тільки на початок ланцюга (pp x A- або pp x G). Іншими словами, включення [32 Р] давало інформацію про ініціацію синтезу, а [14 С] - про сам синтез РНК. У частині дослідів через 3-4 хв після початку інкубації в середу додавали рифампіцин-антибіотик, що перешкоджає ініціації нових ланцюгів РНК, але не впливає на вже розпочатий синтез, тобто на елонгацію. 1 - включення [ 14 С] - UMP, 2 - те саме після додавання рифампіцину; 3 - включення [γ-32 P]-ATP + GTP; 4 - те саме після додавання рифампіцину. На підставі цих кривих включення можна розрахувати основні параметри РНК-полімеразної реакції (за результатами, отриманими Ю. В. Козловим та автором)">
Мал. 26. Вплив гістону H1 на матричну активність ДНК у складі хроматину. а - вплив видалення білків з хроматину (1) на матричну активність (2) останнього в присутності екзогенної РНК-полімерази кишкової палички, а також на гібридизованість РНК, що синтезується (3). Гістони і негістонові білки екстрагували розчинами NaCl концентрації, що підвищується. В інтервалі 0,4 М NaCl - 0,6 М NaCl вибірково видалявся гістон H1. Синтезовану РНК гібридизували з надлишком ДНК при проміжних величинах 0 t. Тим самим гібридизованість виявляє відсотковий вміст у синтезованій РНК повторюваних послідовностей (за результатами, отриманими Л. Н. Ананьєвою, Ю. В. Козловим та автором); б - основні параметри синтезу РНК на різних матрицях: вільної ДНК, вихідному хроматині (ДНП 0) та хроматині, з якого видалений гістон H1 екстракцією 0,6 М NaCl (ДНП 0,6). Синтез РНК вели за допомогою РНК-полімерази кишкової палички у присутності мічених нуклеозидтрифосфатів: [ 14 C]-UTP і або [γ-32 P]-ATP, або [γ-32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP включалася на всю РНК, a [γ- 32 P] - тільки на початок ланцюга (pp x A- або pp x G). Іншими словами, включення [32 Р] давало інформацію про ініціацію синтезу, а [14 С] - про сам синтез РНК. У частині дослідів через 3-4 хв після початку інкубації в середу додавали рифампіцин-антибіотик, що перешкоджає ініціації нових ланцюгів РНК, але не впливає на вже розпочатий синтез, тобто на елонгацію. 1 - включення [ 14 С] - UMP, 2 - те саме після додавання рифампіцину; 3 - включення [γ-32 P]-ATP + GTP; 4 - те саме після додавання рифампіцину. На підставі цих кривих включення можна розрахувати основні параметри РНК-полімеразної реакції (за результатами, отриманими Ю. В. Козловим та автором)

Досліджувалися також властивості синтезованої in vitroРНК за допомогою гібридизації з тотальної ДНК мишей. При цьому виявлялася фракція РНК, синтезована на послідовностях ДНК, що повторюються. Виявилося, що в хроматині транскрипція послідовностей ДНК, що повторюються, обмежена. Однак після екстракції хроматину 0,6 М NaCl, коли видалявся гістон H1, гібридизаційні властивості РНК, синтезованої на матриці такого хроматину і на матриці вільної ДНК, ставали невиразними. Ми припустили, що гістони H2a, H2b, H3 і H4 (тоді їх називали інакше - помірно багаті лізином і багаті на аргінін гістони) не беруть участь у придушенні транскрипції, а відіграють суто структурну роль в організації хроматину, тоді як гістон H1 (в старій термін , багатий на лізин) є інгібітором синтезу РНК. Одночасно він є фактором, що зумовлює конденсацію хроматину (див. вище).

Пізніше Ю. В. Козлов вивчив механізм інгібування транскрипції гістоном H1, знову ж таки на безклітинній системі з РНК-полімеразою, виділеною з Е, coli. Було вивчено вплив гістону H1 на процеси ініціації та елонгації (див. рис. 26, табл. 4). Виявилося, що він у кілька разів знижує кількість ланцюгів РНК, що ініціюються на матриці нативного хроматину. Особливо різко інгібується елонгація: РНК-полімераза прочитує трохи більше 100-150 п. зв. ДНК, після чого зупиняється. Тим часом на хроматині, з якого гістон H1 видалений, РНК-полімераза прочитує кілька тисяч пар нуклеотидів, причому довжина ланцюгів не відрізняється від довжини ланцюгів, синтезованих на матриці вільної ДНК. Щоправда, на вільній ДНК порівняно з хроматином, з якого видалено гістон H1, ефективніше йдуть процеси ініціації синтезу РНК. Було зроблено висновок, що гістон H1, конденсуючи хроматин, створює перешкоди по дорозі РНК-полимеразы і зупиняє цим синтез РНК.

* (ДНПМ – ДНП, ізольований за допомогою обробки сечовиною, який повністю солюбілізований, але при цьому зберігає гістон H1.)

У світлі сучасних даних про соленоїдну будову 300 А-ДНП фібрили, яка залежить від присутності гістону H1, цей результат легко можна пояснити. Дійсно, в соленоїді РНК-полімераза, очевидно, не може прочитати понад 100 п. н. через суто топологічні заборони.

Згідно з нашою гіпотезою, при активації гена мало відбуватися видалення гістону H1. Проте перевірити її на той час не вдалося. Лише порівняно недавно з'явилися дані про втрату гістону H1 з хроматину активації генів. Так, при виділенні областей хроматину, що активно транскрибуються, наприклад міні-ядерців з ряду організмів, у них не був виявлений гістон H1. Немає його і дріжджів, де всі гени потенційно активні.

Переконливі результати були отримані у лабораторії А. Д. Мирзабекова В. Л. Карповим та О. В. Преображенською. Вони розробили метод "гібридизації з тінями гістонів". Для цього ДНК зшивали з гістонами за допомогою диметилсульфату в умовах, коли в середньому пришивається одна молекула гістону на відрізок ДНК довжиною близько 200-300 п. н. Потім ДНК фрагментували та проводили двовимірний електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію. Після прогону в першому напрямку руйнували пришиті до ДНК гістони протеїназою і вели розгін у другому напрямку вже вільної ДНК. Так як при першому раунді електрофорезу різні гістони по-різному уповільнювали рух фрагментів ДНК, то після другого прогону виявлялося кілька діагоналей (рис. 27). Зазвичай добре видно три: одна, що відповідає вихідно вільної ДНК, інша - вихідним комплексам ДНК із серцевинними гістонами і третя (нижня) - вихідному комплексу ДНК із гістоном H1. Отримані ДНК переносяться на фільтр та гібридизуються з тією чи іншою пробою. Якщо для гібридизації брали неактивну ділянку геному, наприклад, спейсер рибосомного гена дрозофіли, то мітка зв'язувалася з усіма діагоналями. Якщо, однак, як пробу використовували ген теплового шоку, який транскрибувався в клітинах, з яких виділяли хроматин, то гібридизація з діагоналлю, яка відповідає комплексам ДНК з гістоном H1, була різко ослаблена або взагалі була відсутня. Іншими словами, в ядрах перед пришивкою ДНК гена, що транскрибується, не мала контактів з гістоном H1.

Мал. 27. Втрата гістону H1 та серцевинних гістонів при активації транскрипції. Досліди велися на клітинах культури D. melanogaster (а, б) в умовах культивування при 25 ° (а) та теплового шоку (б). У випадку експресія генів теплового шоку відсутня, у випадку б - йде дуже активно. Крім того, досліди велися на дехоріонізованих ембріонах, де експресія генів теплового шоку знаходиться на середньому рівні. Після утворення ДНК-білкових комплексів, виділення фрагментів ДНК, їх двовимірного поділу (у вертикальному напрямку після видалення білка) та перенесення на фільтр вели гібридизацію одних і тих же фільтрів з різними пробами: з регуляторною областю гена Р70 теплового шоку (ТШ-5") з кодуючою областю того ж гена (ТШ-код), з пробою транскрипційно неактивної інсерції в ген рДНК (неакт.) У неактивному гені видно три діагоналі, 1 - вільна ДНК, 2 - комплекси ДНК з гістонами октамера; З гістоном H 1. Видно ослаблення або зникнення ДНК-гістонових комплексів при активації хроматину (за результатами, отриманими А. Д. Мірзабековим та співавт.)

Хоча всі наявні дані, взяті окремо дозволяють й інші інтерпретації, разом вони є серйозним свідченням на користь видалення гістону H1 з активного хроматину. Однак механізм цього процесу поки що зовсім не зрозумілий.

Доля нуклеосом під час активації хроматину 2 * [154-157]. Менш однозначним є питання долі гістонів H2a, H2b, H3 і H4, формують серцевину нуклеосоми. У вищезгаданих дослідах Ю. В. Козловаїхня присутність практично не впливала на транскрипцію ДНК РНК-полімеразою з E. coli.При вивченні продуктів гідролізу хроматину еукаріотів багато авторів виявили, що нуклеосоми містять ДНК активних генів, тобто останні теж організовані в нуклеосоми. Отримані на великому експериментальному матеріалі дані А. Д. Мирзабековата співр. показують, що нуклеосоми, які містять активно транскрибируемую ДНК, принципово влаштовані так само, як і нуклеосоми, що містять неактивну ДНК, хоча деякі ДНК-гістонові контакти в них змінюються.

Були також проведені досліди з гібридизації з тінями гістонів, про які йшлося у попередньому розділі (див. рис. 27). Препарати з діагоналями готували з клітин дрозофіли, в яких гени теплового шоку або взагалі не працювали, тобто були вимкнені, або вони працювали на низькому рівні, або, нарешті, стимулювали тепловий шок до активної транскрипції. У всіх випадках контрольною пробою служила ДНК спейсера рибосомного гена, яка гібридизувалась у всіма трьома діагоналями, у тому числі з діагоналлю, що походить з комплексів ДНК із серцевинними гістонами.

Ген теплового шоку теж нормально гібридизувався із цією діагоналлю з клітин, де він не транскрибувався. Однак з матеріалом, отриманим з клітин з помірною транскрипцією гена теплового шоку, гібридизація другої діагоналі була значно знижена. Нарешті, якщо діагоналі отримували з клітин з дуже активним синтезом мРНК теплового шоку, то друга діагональ при гібридизації взагалі була не видно (як і третя), і виявлялася лише діагональ, що відповідала не пошитою з гістонами ДНК- Загальний висновок, зроблений з робіт з використанням методу ДНК-білкових зшивок, полягав у тому, що при транскрипції РНК-полімераза, що рухається вздовж ланцюга ДНК РНК-оборотно зіштовхує нуклеосоми з ДНК і транскрибує фактично голу ДНК. Якщо рівень транскрипції невисокий і РНК-полімераз, що повз уздовж ДНК, небагато, то нуклеосоми встигають утворитися знову на ділянці, через яку РНК-полімераза вже пройшла. Якщо транскрипція йде активно, то нуклеосомна структура ДНК не встигає відновитися, і ДНК взагалі позбавлена ​​гістонів. У той же час постулюється, що організація нуклеосом в активному хроматині практично не відрізняється від такої в неактивному. Нещодавно А. Д. Мірзабеков та співр. відтворили досліди з пришивки гістонів до ДНК за допомогою іншого методу шляхом обробки ізольованих ядер препаратами платини. Цей метод м'якший за диметилсульфатний. Були отримані ті ж результати.

Поряд із цією групою даних є дослідження, в яких автори приходять до дещо відмінних висновків. В. Гаррард та А. Ворсел(США), вивчаючи стан активних генів у хроматині за допомогою нуклеазного гідролізу та за допомогою електронної мікроскопії, дійшли висновку про те, що нуклеосоми в активному хроматині залишаються, але зазнають структурних змін типу розвороту, перетворюючись на напівнуклеосоми. В результаті на електрофореграмах гідролізатів мікрококовою нуклеазою періодичність ~ 200 п. н. замінюється періодичністю ~ 100 п. зв. При електронній мікроскопії число намистин подвоюється, які розміри зменшуються. Передбачається, що РНК-полімераза може проходити через такі розгорнуті нуклеосоми.

На користь цієї можливості свідчать і дані, отримані Т. Коллером(Швейцарія). Їм розроблено оригінальний методВивчення нуклеосом. Клітини обробляють псораленом, речовиною, що зв'язується з ДНК, і потім при УФ опроміненні зшиває між собою два ланцюги ДНК. Однак, якщо ДНК входить до складу нуклеосом, реакції її з псораленом не відбувається. Тому, якщо виділену з оброблених клітин ДНК проденатурувати в присутності формальдегіду (він перешкоджає ренатурації ДНК), то при електронній мікроскопії на ДНК видно чергуються бульбашки (два ланцюги ДНК, що денатурувала), відповідні нуклеосомам, пов'язані між собою ординарними нитками. ДНК), що відповідають міжнуклеосомним лінкерам. Спочатку вивчали гени рибосомної РНК, що активно транскрибуються, входять до складу екстрахромосомних структур і тому легко аналізуються за допомогою електронної мікроскопії. Вони бульбашки, відповідні нуклеосомам, не видно, т. е. ймовірно, гістони повністю видаляються з областей, що транскрибуються. Цікаво, що в областях, що не транскрибуються, спейсерах, бульбашки в ДНК (нуклеосоми) добре видно.

Однак на міні-хромосомах SV40, які транскрибуються РНК-полімеразою II, а не РНК-полімеразою I, як гени рибосомної РНК, були отримані інші результати (рис. 28). Транкскрипційно активні міні-хромосоми виявляються завдяки наявності на них ланцюгів РНК, що ростуть (зазвичай одного або двох). Такі міні-хромосоми становлять 1-2% всіх міні-хромосом, виділених з клітини. Вони, однак, містять те ж саме бульбашок, що і неактивні міні-хромосоми, причому їх розміри однакові в обох випадках. Найбільш цікавим є те, що ланцюги РНК відходять як від лінкерів, так і безпосередньо від бульбашок, тобто РНК-полімераза, очевидно, транскрибує нуклеосоми. Ці дані свідчать на користь розвороту нуклеосом та транскрипції їх РНК-полімеразою.

Усі перелічені вище результати є прямими, і тому остаточне рішенняПитання долі нуклеосом при транскрипції повинні дати майбутні експерименти.

Модифікація гістонів та гістонові варіанти: зв'язок з активним хроматином. Ще на початку 60-х років Олфрі (США) показав, що гістони можуть піддаватися різним модифікаціям. Так, гістон HI фосфорилюється по ε-аміногруп лізинів. Гістони H3 та H4 ацетилюються за тими ж групами. Є й інших модифікацій (метилювання, ADP - рибозилювання, убикитинирование та інших.).

Відразу виникло припущення, що ензиматичні модифікації гістонів можуть впливати на структуру хроматину та його активність. Дійсно, при фосфорилуванні лізину відбувається заміна одного позитивного заряду в гістоні на негативний, при апелюванні - втрата позитивного заряду і т. д. Саме завдяки таким змінам в заряді модифіковані гістони можна відокремити від немодифікованих при проведенні гель-електрофорезу в ацетатному буфері Так, у високороздільному електрофорезі гістон H4 дає не одну, а чотири смуги, що відповідають молекулам, не ацетильованим і ацетильованим по одному, двом і трьом залишкам лізину. У різних тканинах співвідношення між фракціями змінюється. Поділяються на кілька фракцій гістони H3, H2a, H2b та H1 (різний ступінь ацетилювання та фосфорилювання).

На жаль, досі відсутні хороші методи поділу транскрипційно активного та неактивного хроматину і тому важко приписати змінені форми гістонів тому чи іншому стану хроматину. Найбільш цікаві дані в цьому напрямку були отримані тим самим В. Олфрі(США). При гідроліз активного хроматину він виділив незвичайні частинки, які седиментували в сахарозному градієнті повільніше, ніж звичайні нуклеосоми, і, на думку автора, відповідали розгорнутим нуклеосомам. У цих частках, названих А-частинками, були всі серцевинні гістони. На відміну від нормальних нуклеосом SH-групи гістону H3 в А-частинках були доступні для ряду хімічних реагентів, і завдяки цьому А-частинки можна відокремити від нуклеосом за допомогою фракціонування на колонках з хлормеркурибензоатом (реагент, що зв'язує SH-групи). В А-частинках підвищено вміст ацетильованих форм гістонів. Автор передбачає, що ацетилювання гістонів при активації хроматину веде до розвороту нуклеосомних частинок, а це, у свою чергу, підвищує доступність SH-груп гістону H3.

Деякі з гістонів кодуються більш ніж одним типом генів. В результаті для цих гістонів існує кілька варіантів, що трохи відрізняються за своєю амінокислотною послідовністю. Іноді у процесі онтогенезу відбувається закономірна заміна одного підкласу гістону на інший. Залишається, однак, незрозумілим, чи це має якесь регуляторне значення. Питання, очевидно, може бути вирішене після розробки адекватних методів виділення транскрипційно активного хроматину.

Особливе становище займає гістон H1. Для нього існують варіанти, що різко відрізняються за своєю структурною організацією. Таким варіантом є, наприклад, гістон Н5, який замінює значну частину гістону H1 у ядрах еритроцитів птахів. Цілком імовірно, це заміщення є важливим фактором повного виключення транскрипції в ядрах еритроцитів. У звичайних клітинахІснує варіант гістону H1 - гістон H1 0 . Його зміст становить малу частку всього гістону H1. Є ряд даних, що суперечать один одному, про те, що H1 0 пов'язаний з активними генами або, навпаки, із стійко вимкненими генами. Питання залишається відкритим.

Білки HMG можуть брати участь в організації активного хроматину 1*. Крім гістонів, хроматин містить багато негістонових білків, функція яких не відома. Серед них, очевидно, мають бути структурні білки, ферменти, що забезпечують перебіг процесів реплікації, транскрипції та ін, та регуляторні білки. Е. Джонс(Великобританія) спробував виділити білкові компоненти, присутні у досить великій кількості, що дозволило б провести їхній аналіз та ідентифікацію. Йому справді вдалося ізолювати новий класядерних білків, названий ним "групою білків з високою рухливістю" ( high mobility group), або HMG-білки. Назва залежала від високої рухливості цих білків при електрофорез у гелі. Фракція HMG-білків розпадається на низку індивідуальних компонентів. Серед них найбільш представницькі та добре охарактеризовані HMG-1, HMG-2, HMG-14 та HMG-17.

HMG-білки мають невисоку молекулярну масу. Вони збагачені як основними, і дикарбоновыми амінокислотами. Зміст HMG-білків становить приблизно 7 від вмісту гістонів. У ядрах з різних типівклітин воно може варіювати. У цьому контексті нас найбільше цікавлять білки HMG-14 та HMG-17, для яких були отримані дані про можливу роль в активації транскрипції. Х. Вайнтрауб(США) показав, що екстракція ядер 0,35 М NaCl, яка отримує HMG-білки, змінює деякі властивості активного хроматину, які відновлюються при додаванні до хроматину HMG-14 і HMG-17. Г. Діксон(Канада) виявив ці білки у складі нуклеосом, що звільнялися з хроматину на ранніх етапах гідролізу нуклеазою, які, за його даними, були збагачені ДНК тракстипційно активних генів.

Кінцям [ 32 Р] і потім гібридизували з гяРНК з L-клітин. Гібриди виявляли шляхом гельфільтрації. 1 - CH-2 ДНК; 2 - CH-3 ДНК; 3 - тотальна ДНК клітини (за результатами, отриманими В. В. Бакаєвим та співавт.)">
Мал. 29. Можливий зв'язок HMG-білків (14 та 17) з активним хроматином. а - виявлення субнуклеосом у гідролізатах хроматину мікрококовою нуклеазою. На різних етапах гідролізу з'являються ті чи інші субнуклеосові фракції. Електрофорез вівся у поліакриламідному гелі в неденатуруючих умовах. Забарвлення етидійбромідом, на правому стовпчику – флюорографія; б - використання двовимірного електрофорезу для з'ясування білкового складу субнуклеос CH2 і CH3. Хроматин, мічений [ 14 С] по білку, гідролізували мікрококовою нуклеазою і розділяли двовимірним електрофорезом (1-й напрямок - недисоціююче середовище, 2-й напрямок - розчин додецилсульфату натрію), після чого вели авторадіографію для виявлення білків. Літерами зазначені HMG-білки, які в момент проведення досвіду ще не були ідентифіковані з відомими. Зараз ми знаємо, що А – це HMG-1, В – HMG-2, E – HMG-14, G – HMG-17, HMG-білки F та H ідентифіковані неточно, ймовірно, H теж відповідає HMG-17. Видно, що HMG-білки входять до складу мононуклеосом (МН-2 та МН-3) та субнуклеосом CH-2 (HMG-17) та CH-3 (HMG-14); в - демонстрація збагачення ДНК CH-2 і CH-3 послідовностями, що транскрибуються. ДНК, виділену зі смуг CH-2 і CH-3 L-клітин, метили по 5"-кінцям [ 32 Р] і потім гібридизували з гяРНК з L-клітин. Гібриди виявляли шляхом гельфільтрації. 1 - CH-2 ДНК; 2 - CH-3 ДНК; 3 - тотальна ДНК клітини (за результатами, отриманими В. В. Бакаєвим та співавт.)

В. В. Бакаєву нашій лабораторії дійшов висновку про роль HMG-білків у транскрипції за допомогою іншого експериментального підходу. При електрофоретичному аналізі гідролізатів хроматину він виявив, крім нуклеосом і олігонуклеосом, мінорні компоненти, що мають більшу рухливість. Вони були названі субнуклеосомами та, очевидно, були продуктами подальшого розпаду нуклеосоми (рис. 29, табл. 5). Субнуклеосома СН-7 відповідала нуклеосомі, яка втратила по одній молекулі Н2а і Н2Ь і містила ДНК, укорочену на 40 п. н., СН-6 відповідала комплексу ДНК завдовжки 30-40 п. н. з гістоном H1, що відщеплюється від МН-2 при її перетворенні на МН-1. СН-4 містила відрізок ДНК та пару гістонів H2a та H2b (продукт реакції МН-1→СН-7→СН-4). Дві субнуклеосоми, СН-3 та СН-2, складалися з короткої ДНК та HMG-білків (HMG-14 та HMG-17). Можна було припустити, що вони є ділянками лінкера, пов'язаними з білками HMG-14 і HMG-17, що переходять у розчин при перетравленні нук-леосом відповідних. СН-2 та СН-3 були зібрані, з них виділено ДНК, яку метили по кінцях та вивчали її гібридизацію з ядерної РНК. Виявилося, що ДНК із СН-2 та СН-3 набагато ефективніше гібридизується з ядерною РНК, ніж тотальна, фрагментована до тих самих розмірів ДНК клітини.

Звідси було зроблено висновок, що ДНК, пов'язана з білками HMG-14 та HMG-17, ймовірно, походить з транскрипційно активного хроматину.

Всі ці дані, отримані незалежно, дозволили припустити, що HMG-14 та HMG-17 якимось чином пов'язані з активацією генів. Механізм активації був, однак, незрозумілим. HMG-14 та HMG-17 не могли бути первинними факторами, що включають ген, оскільки вони позбавлені специфічності. Можна було думати, що вони беруть участь у підтримці "відкритої конформації" активного хроматину.

У наступні роки з'явився скептицизм щодо ролі HMG-14 та HMG-17 в активації хроматину. Зокрема, нещодавно А. Д. Мирзабековта співр. за допомогою методу гібридизації з білковими тканинами отримали дані про збіднення активного хроматину HMG-14 та HMG-17. Оскільки, проте, перераховані вище дані є непрямими, загалом питання ролі HMG-белков залишається відкритим і вимагає подальшого вивчення.

Топоізомераза I та білки, міцно пов'язані з ДНК, входять до складу транскрипційно активного хроматину. 1*. С. Елгін (США), а за нею ряд інших авторів показали, що транскрипційно активний хроматин містить топоізомеразу I, фермент, що релаксує суперспіралізовану ДНК. Вперше це було продемонстровано на цитологічних препаратах політенних хромосом дрозофіли за допомогою флюоресцирующих антитіл до топоізомерази I. Цей фермент вносить до ДНК одноланцюжковий розрив і ковалентно зв'язується з 5"-кінцем ДНК, що утворився. Це дозволяє ДНК вільно обертатися в місці розриву. фосфодіефірний зв'язок у ДНК відновлюється.По молекулярній масі топоізомеразу I, або скорочено топо I, гетерогенна.Найважчий компонент має молекулярну масу 135 кДа, а найбагатше представлений - 80 кДа.При її розщепленні протеїназами утворюються коротші поліпептиди, що зберігають проте ферментативну активність.

Антибіотик каптотецин є інгібітором топо I, причому при обробці ним клітин фермент утворює ковалентні зшивки з ДНК там, де він знаходився в момент контакту з антибіотиком. Місце таких зшивок легко визначити методом картування за допомогою мітки гібридизаціі. Цим шляхом було виявлено, що топо I присутній виключно в областях, що транскрибуються геному, тобто, найімовірніше, вона працює в кооперації з РНК-полімеразою II, знімаючи виникаючі при транскрипції місцеві перекручування ДНК.

Іншим білковим компонентом, що виявляється в областях, що транскрибуються геному, є набір білків, міцно пов'язаних з ДНК (ПСБ), яка відповідає транскрибируемой ДНК клітини (див. розд. 3.4).

С. В. Разіним та В. В. Чорнохвостовимбула зроблена спроба детально охарактеризувати комплекси ДНК із ПСБ. Фрагменти ДНК довжиною 1-2 т. п. н., пов'язані з ПСБ, очищали і піддавали рівноважному ультрацентрифугування в градієнті щільності CsCl. Їхня плавуча щільність виявилася рівною 1,7 г/см3, Т. е. вона відповідала плавучої щільності вільної ДНК, що не містить білка. У ході дослідів, поставлених для пояснення цього парадоксу, було виявлено, що обробка ДРНКазою веде до зменшення плавучої густини комплексів до 1,62-1,65 г/см 3. Приблизні розрахунки, засновані на густині білка ( ~ 1,3 г/см 3) та РНК ( ~ 1,9 г/см 3), (показують, що на кожну молекулу ДНК припадає близько 150 кДабілка та близько 200 нуклеотидів РНК. Природа цієї РНК неясна, але отримані дані про її гомогенність та унікальну нуклеотидну послідовність.

Таким чином, багато щодо комплексів ДНК з ПСБ залишається загадковим, але, ймовірно, їм належить істотна роль в організації транскрипційної машини. Їх дослідження триває нині.

Деметилювання ДНК в генах, що транскрибуються. 2*. Ще однією важливою особливістюактивним хроматином є деметилювання певних ділянок ДНК. У неактивних генах більшість цитидилових залишків у складі CG-послідовностей метилюється. Вперше Б. В. Ванюшинв лабораторії А. Н. Білозерськогобуло продемонстровано, що ДНК у різних тканинах однієї тварини розрізняються за рівнем метилювання С. На підставі цього було висловлено припущення про можливу регуляторну роль метилювання в диференціювання. Пізніше багатьма авторами було показано, що в ДНК, що транскрибується, деякі області виявляються недометильованими. Найбільш широко використовуваний метод аналізу - порівняння рестриктних карт, отриманих з рестриктазами, які впізнають одну і ту ж послідовність, наприклад CGCG або CCGG, але мають різною чутливістюдо метилювання. Одна з рестриктаз розщеплює і метильовану та неметильовану послідовності, а інша – тільки неметильовану. Зазвичай неметильовані послідовності локалізовані у регуляторній ділянці гена. Область власне гена, його кодуючої частини та інтронів однаково метильована як у працюючих, так і в мовчазних генах.

При введенні у клітини метильованої ДНК її експресія у клітині виявляється значно зниженою порівняно з неметильованою ДНК. Отримано дані, згідно з якими при реплікації ДНК стан метилювання ДНК відтворюється: якщо один з ланцюгів метильований, то новостворений ланцюг також метилюється в тому самому місці.

У свій час складалося враження, що метилювання-деметилювання цитидину в CG-послідовностях регуляторної області - це головний механізм інактивації-активації гена. Однак у Останнім часомз'явився ряд даних, що суперечать цій гіпотезі. Так, повністю метильована CG ДНК SV40 активно експресується. У той самий час у ДНК дрозофіли взагалі виявляється метилцитозин. Можливо, що деметилювання є наслідком активації гена і лише закріплює стан транскрипційної активності. Тут, як і інших областях вивчення активації гена, потрібні нові експерименти.

Для виділення хроматину використовують його властивість переходити до розчиненого стану при екстракції водними розчинами з низькою іонною силою.

Білки-гістони складають від 40 до 80% всіх білків, що входять до складу виділеного хроматину (інше – мембранні компоненти, РНК, вуглеводи, ліпіди, глікопротеїди)

У структурному відношенні хроматин (нуклеогістон) є комплексними нитчастими молекулами дезоксирибонуклеопротеїду ( ДНП), які складаються з ДНК, асоційованої з гістонами.

Товщина нитчастих фібрил ДНП: 10-30 нм

Молекулярна маса ДНК хроматину: 7-9*10^6

Концентрація ДНК в інтерфазному ядрі:до 100 мг/мл.

У середньому на інтерфазне ядро ​​припадає близько 2 м ДНК, яка локалізується у сферичному ядрі із середнім діаметром близько 10 мкм. Це означає, що така величезна маса ДНК має бути покладена з коефіцієнтом упаковки 1*10^3 – 1*10^4

Еукаріотичні клітини містять лише 5-7 типів молекул гістонів.

Взаємодія гістонів з ДНК відбувається за рахунок сольових або іонних зв'язків і неспецифічно щодо складу та послідовності нуклеотидів у ДНК.

Основні властивості гістонів:

1) Це лужні білки, властивості яких визначаються відносно високим вмістом таких основних амінокислот, як лізин та аргінін (обумовлюються наявністю позитивних зарядів на аміногрупах лізину та аргініну)

2) Щодо невелика молекулярна маса.

Гістони H3 та H4відносять до аргінінбагатих, H2A та H2Bвідносять до білків, помірно збагаченим лізином. Гістони H1збагачені лізином.

У гістону H1 найбільш варіабельним є N-кінець, що здійснює зв'язок з іншими гістонами, а С-кінець, багатий на лізин, взаємодіє з ДНК.

Гістони синтезуються в цитоплазмі, транспортуються в ядро ​​і зв'язуються з ДНК під час її реплікації в S-періоді, тобто синтези гістонів та ДНК синхронізовані.

Рівні компактизації ДНК:

1) Нуклеосомний

2) Нуклеомірний

3) Хромомірний

4) Хромонімний

5) Хроматидний

1) Укладання гістонами.

Типи гістонів: H1, H2A, H2B, H3, H4.

Гістони заряджені позитивно, добре взаємодіють із негативно зарядженою ДНК.

Гістон Н1 відокремлюється у розчині 0,6М NaCl. Усі гістони відокремлюються у 2М розчині.

N-кінець гістону взаємодіє з іншими гістонами, він варіабельний. С-кінець консервативний та взаємодіє з ДНК.

Найбільш консервативні гістони - Н3 та Н4.

Нуклеосома- Дискретна частка хроматину. На весь гаплоїдний геном людини припадає 1,5*10^7 нуклеосом.

Коефіцієнт укладання з гістонами К=7, ДНК коротшає в 7 разів.

Одна обмотка= 146 пар нуклеотидів. між нуклеосомами ( лінкер) 54 пари нуклеотидів. Періоддорівнює 200 нуклеотидів.

Укладання майже двох витків ДНК по периферії серцевини нуклеосоми відбувається, як вважається, рахунок взаємодії позитивно заряджених амінокислотних залишків на пов-ти октаметра гістонів з фосфатами ДНК.

Ключовими у побудові нуклеосом виявилися гістони H3 та H4 (див. малюнок у зошиті!!!)

У час синтезу ДНК вже існує пул мінтезованих гістонів всіх класів, готових увійти до складу нуклеосом. Гістонові гени, що відносяться до фракції послідовностей ДНК, що помірно повторюються, представлені у вигляді множинних копій для кожного гістону. Вони активуються разом із початком синтезу ДНК, тому принаймні просування реплікаційної виделки нові ділянки ДНК можуть одночасно взаємодіяти з новосинтезованими гістонами.

Новосинтезовані гістони та старі гістони у складі попередніх нуклеосом не поєднуються при утворенні нуклеосом під час реплікації ДНК. Натомість октаметри гістонів, присутні до реплікації, залишаються інтактними і переходять на дочірній дуплекс ДНК, тоді як нові гістони збираються в абсолютно нові кор-частинки на вільних від нуклеосом ділянках ДНК.

2) Фібрилла (30нм)

Соленоїдний тип укладання:Спіраль, зигзагоподібне укладання (один виток – 6 нуклеосом). Вважається, що гістон Н1 забезпечує взаємодію між сусідніми нуклеосомами, не тільки зближуючи та зв'язуючи їх, але й сприяючи утворенню кооперативного зв'язку між сусідніми нуклеосомами, завдяки чому утворюється щільна спіраль. (Щільність упаковки – 40)

Показано, що фібрил хроматину діаметром 30 нм. може оборотно змінювати свій діаметр: ставати фібрилою завтовшки 10 нм, якщо препарати хроматину перевести в деіонізовану воду.

Другий тип укладання: 25-30 нм нуклеомери, глобулярне укладання. 40-кратне ущільнення ДНК.

Укладання майже двох витків ДНК по периферії серцевини нуклеосоми

Модель нерегулярного соленоїда:число нуклеосом на виток спіралі не є строго постійною величиною, що може призвести до чергування ділянок з більшим чи меншим числом на виток нуклеосом.

3) Хромоміри (60-80 нм)

Петльова модель укладання. Середній розмір петель- 60 т.п.н.

Кількість петель в розетці – 15-80.

Основа петель закріплена всередині ядра, на ділянках негістонових білків.

4) Хромонема (100 нм)

У рослин можна побачити в інтерфазних ядрах, у тварин – у телофазі, у процесі деконденсації.

5) Хроматида.

Також у ядрі присутні негістонові білки:

1) SIR (silent information regulator)

білки, що взаємодіють з гетерохроматином, модифікують N-кінець гістонів, інактивація хроматину.

2) H3-CENPA (centromer protein)

локалізований у центрі, конститутивний гетерохроматин, стабільна інактивація.

3) HP1 (heterochromatin protein 1)

4) HP1+H3+метилтрансфераза+деацетилаза (видалення ацетильних груп) = пригнічення транскрипції.

5) В області кінетохори спостерігається структурне утворення – корона. Воно містить багато білків, функції більшості їх невідомі.

6) Білки HMG («білки Джонса») – High Mobility Group

Основні HMG-білки: HMG-1, HMG-2, HMG-14, HMG-17. Є регуляторами транскрипції.

Моделі будови хромосом:

1) Модель сплутаних ниток

2) Хаотична модель

3) Петльова модель

4) Соленоїдна модель

Генетичний матеріал еукаріотів має дуже складну організацію. Молекули ДНК, що у клітинному ядрі, входять до складу особливого багатокомпонентного речовини – хроматину.

Визначення поняття

Хроматином називається матеріал клітинного ядра, що містить спадкову інформацію, що являє собою складний функціональний комплекс ДНК зі структурними білками та іншими елементами, що забезпечують упаковку, зберігання та реалізацію каріотичного геному. У спрощеному трактуванні ця речовина, з якої складаються хромосоми. Термін походить від грецького "хрому" - колір, фарба.

Поняття було запроваджено Флемінгом ще 1880 року, але досі точаться суперечки у тому, що таке хроматин, з погляду біохімічного складу. Невизначеність стосується невеликої частини компонентів, що не беруть участь у структуруванні генетичних молекул (деякі ферменти та рибонуклеїнові кислоти).

На електронній фотографії інтерфазного ядра хроматин візуалізується як численні ділянки темної матерії, які можуть бути дрібними та розрізненими або об'єднуватись у великі щільні скупчення.

Конденсація хроматину під час клітинного поділу призводить до утворення хромосом, що видно навіть у звичайному світловому мікроскопі.

Структурні та функціональні компоненти хроматину

З метою визначення, що таке хроматин на біохімічному рівні, вчені екстрагували цю речовину з клітин, переводили в розчин і в такому вигляді вивчали компонентний склад та структуру. У цьому використовувалися як хімічні, і фізичні методи, включаючи технології електронної мікроскопії. Виявилося, що хімічний складхроматину на 40% представлений довгими молекулами ДНК та майже на 60% – різними білками. Останні поділяються на дві групи: гістони та негістонові.

Гістонами називають велику родину основних ядерних білків, які міцно зв'язуються із ДНК, формуючи структурний скелет хроматину. Їх кількість приблизно дорівнює процентному вмісту генетичних молекул.

Решта (до 20%) протеїнової фракції припадає на ДНК-зв'язувальні та просторово-модифікуючі білки, а також ферменти, що беруть участь у процесах зчитування та копіювання генетичної інформації.

Крім основних елементів, у складі хроматину в невеликій кількості виявляються рибонуклеїнові кислоти (РНК), глікопротеїди, вуглеводи та ліпіди, проте питання про їх асоціацію з ДНК-пакувальним комплексом досі відкрите.

Гістони та нуклеосоми

Молекулярна маса гістонів варіює в межах від 11 до 21 кДа. Велика кількість залишків основних амінокислот лізину та аргініну надають цим білкам. позитивний заряд, сприяючи формуванню іонних зв'язків із протилежно зарядженими фосфатними групами подвійної спіралі ДНК

Виділяють 5 різновидів гістонів: H2A, H2B, H3, H4 та H1. Перші чотири типи беруть участь у формуванні основної структурної одиниці хроматину – нуклеосоми, яка складається з кора (білкової серцевини) та обмотаної навколо нього ДНК.

Нуклеосомний кор представлений октамерним комплексом з восьми молекул гістонів, до якого входять тетрамер H3-H4 та димер Н2A-H2B. Ділянка ДНК довжиною близько 146 нуклеотидних пар накручується на поверхню білкової частки, утворюючи 1,75 витка, і переходить у лінкерну послідовність (приблизно 60 н. п.), що з'єднує нуклеосоми один з одним. Молекула H1 зв'язується з лінкерною ДНК, захищаючи її від дії нуклеазу.

Гістони можуть піддаватися різним модифікаціям, таким як ацетилювання, метилювання, фосфорилювання, ADP-рибозилювання та взаємодія з убівіктиновим білком. Ці процеси впливають на просторову конфігурацію та щільність упаковки ДНК.

Негістонові білки

Існує кілька сотень різновидів негістонових білків з різними властивостямита функціями. Їхня молекулярна маса варіює від 5 до 200 кДа. Особливу групу складають сайт-специфічні білки, кожен з яких комплементарний певній ділянці ДНК. До цієї групи входять 2 сімейства:

• "цинкові пальці" – дізнаються фрагменти завдовжки 5 нуклеотидних пар;
• гомодімери - характеризуються структурою "спіраль-поворот-спіраль" у фрагменті, пов'язаному з ДНК.

Найкраще вивчені так звані білки високої рухливості (HGM-білки), які постійно асоціюються з хроматином. Таке найменування сімейство отримало через високої швидкостіпереміщення білкових молекул у електрофорезному гелі. Ця група займає більшу частину негістонової фракції і включає чотири основні типи HGM-білків: HGM-1, HGM-14, HGM-17 і HMO-2. Вони виконують структурну та регуляторну функції.

До негістонових білків відносять також ферменти, що забезпечують транскрипцію (процес синтезу матричної РНК), реплікацію (подвоєння ДНК) та репарацію (усунення пошкоджень у генетичній молекулі).

Рівні компактизації ДНК

Особливість структури хроматину така, що дозволяє ниткам ДНК із сумарною довжиною понад метр поміститися в ядро ​​діаметром близько 10 мкм. Таке можливе завдяки багатоступінчастій системі упаковки генетичних молекул. Загальна схемакомпактизації включає п'ять рівнів:

1. нуклеосомна нитка діаметром 10-11 нм;
2. фібрили 25-30 нм;
3. петлеві домени (300 нм);
4. волокно завтовшки 700 нм;
5. хромосоми (1200 нм).

Така форма організації забезпечує зменшення довжини вихідної молекули ДНК у 10 тисяч разів.

Нитка діаметром 11 нм утворена поряд нуклеосом, пов'язаних лінкерними ділянками ДНК. На електронній мікрофотографії така структура нагадує нанизані на ліску намисто. Нуклеосомна нитка згортається в спіраль за типом соленоїда, утворюючи фібрилу завтовшки 30 нм. У її формуванні бере участь гістон H1.

Соленоїдна фібрила складається в петлі (інакше - домени), які закріплюються на внутрішньоядерному матриксі, що підтримує. Кожен домен містить від 30 до 100 тисяч пар нуклеотидів. Такий рівень компактизації характерний для інтерфазного хроматину.

Структура завтовшки 700 нм утворюється при спіралізації доменної фібрили і називається хроматидою. У свою чергу, дві хроматиди формують п'ятий рівень організації ДНК - хромосому діаметром 1400 нм, яка стає видною на стадії мітозу або мейозу.

Таким чином, хроматин та хромосома – це форми упаковки генетичного матеріалу, що залежать від життєвого циклуклітини.

Хромосоми

Хромосома складається із двох ідентичних один одному сестринських хроматид, кожна з яких утворена однією суперспіралізованою молекулою ДНК. Половинки з'єднуються спеціальним фібрилярним тільцем, що називається центроміром. Одночасно ця структура є перетяжкою, яка поділяє кожну хроматиду на плечі.

На відміну від хроматину, що є структурним матеріалом, хромосома – це дискретна функціональна одиниця, що характеризується як структурою і складом, а й унікальним генетичним набором, і навіть певною роллю у реалізації механізмів спадковості і мінливості на клітинному рівні.

Еухроматин та гетерохроматин

Хроматин у ядрі існує у двох формах: менш спіралізованій (еухроматин) та більш компактній (гетерохроматин). Перша форма відповідає транскрипційно-активним ділянкам ДНК і тому структурована негаразд щільно. Гетерохроматин поділяється на факультативний (може переходити з активної форми в щільну неактивну залежно від стадії життєвого циклу клітини та необхідності реалізувати ті чи інші гени) та конститутивний (постійно ущільнений). Під час мітотичного чи мейотичного поділу весь хроматин неактивний.

Конститутивний гетерохроматин виявлено біля центроміру та в кінцевих ділянках хромосоми. Результати електронної мікроскопії показують, що такий хроматин зберігає високий ступіньконденсації як на стадії поділу клітини, а й під час інтерфази.

Біологічна роль хроматину

Основна функція хроматину полягає в щільній упаковці великої кількостігенетичного матеріалу. Однак просто вмістити ДНК у ядрі для життєдіяльності клітини недостатньо. Необхідно, щоб ці молекули належним чином "працювали", тобто могли передавати укладену в них інформацію по системі ДНК-РНК-білок. Крім цього, клітині слід розподіляти генетичний матеріал під час поділу.

Пристрій хроматину повністю відповідає цим завданням. Білкова частина містить усі необхідні ферменти, а особливості структури дозволяють їм взаємодіяти з певними ділянками ДНК. Тому другою важливою функцією хроматину є забезпечення всіх процесів, пов'язаних з реалізацією ядерного геному.

Розрізняють такі фракції у геномі еукаріотів.

1. Унікальні, тобто. послідовності, подані в одному екземплярі або небагатьма копіями. Як правило, це цистрони – структурні гени, що кодують білки.

2. Низькочастотні повтори – послідовності, що повторюються десятки разів.

3. Проміжні, або середньочастотні, повтори – послідовності, що повторюються сотні та тисячі разів. До них відносяться гени рРНК (у людини 200 на гаплоїдний набір, у миші – 100, у кішки – 1000, у риб та квіткових рослин – тисячі), тРНК, гени рибосомних білків та білків-гістонів.

4. Високочастотні повтори, кількість яких сягає 10 мільйонів (на геном). ДНК мишей на 70% складається з унікальних послідовностей, на 20% – із низькочастотних та середньочастотних повторів, на 10% – із високочастотних.

Повтори утворюють звані сімейства, під якими розуміють сукупність послідовностей, повністю чи здебільшого гомологічних одне одному.

Нерідко через істотні відмінності в нуклеотидному складі високочастотних повторів та решти ДНК перші утворюють при центрифугуванні в градієнті щільності хлористого цезію так звані сателітні піки, які мають більшу або меншу плавучу щільність, ніж решта ДНК. Ця фракція геному представлена ​​невеликим (10...15) числом сімейств коротких (5...12 п.н.) повторів, що утворюють протяжні блоки. Усередині блоків групи повторів окремих сімейств можуть чергуватись один з одним, так що сателітна ДНК має клаптеву структуру. Гібридизація фракцій високочастотних послідовностей із ДНК безпосередньо на препаратах хромосом дозволила встановити, що ця фракція геному локалізована в районах конститутивного гетерохроматину, найчастіше прицентромірного або тіломерного. Ще 30-ті роки було показано, що у генетичному відношенні ці райони інертні, т. е. не містять генів. Насправді такі малі послідовності, що становлять сателітну ДНК, не можуть кодувати нічого, крім олігопептидів. Більше того, гетерохроматичні райони не транскрибуються. Таким чином, у разі високочастотних послідовностей ДНК виявляється тотожність молекулярної організації та генетичних властивостей хромосомної ДНК еукаріотів. Слід зазначити, що ця фракція у більшості видів займає трохи більше 10% геному. Близькі види, наприклад миша і щур, мають зовсім різні високочастотні послідовності, у щура їх нуклеотидний склад не відрізняється від основної ДНК, тоді як геном миші містить чіткий АТ-багатий сателіт. Це означає, що високочастотна ДНК здатна до швидких змін під час видоутворення.

Інші 90% геному еукаріотів, його еухроматична частина, побудовані за принципом чергування (інтерсперсії) унікальних і повторюваних послідовностей. Умовно виділяють два основних типи інтерсперсії, що отримали назви за тими видами, у яких вони вперше були описані: інтерсперсія типу «ксенопус» (виявлена ​​у шпорцевої жаби Xenopus laevis)і типу «дрозофіла» (вперше описана у плодової мушки D. melanogaster). Приблизно в 50% геному Xenopus laevisунікальні послідовності з 800 ... 1200 п.н. чергуються з такими, що повторюються, середній розмір яких 300 п.н. У решті геномів типу «ксенопус» відстані між сусідніми повторами значно перевищують 1...2 п.н. Структура геному типу «ксенопус» поширена, особливо серед тварин. Ссавці та людина також відносяться до цього типу організації геному. Особливість геному людини та інших приматів становлять високочастотні інтерсперсні повтори довжиною близько 300 п.н. У людини ці повтори містять сайт, що розрізається ферментом рестрикції Alu I. Число Alu-подібних повторів у геномі людини досягає 5×10 5 , а за деякими даними, навіть 10 6 .

Alu-подібні послідовності приматів є частковими дуплікаціями (подвоєння) послідовності В1 в геномі гризунів, вперше описаної Г. П. Георгієвим і його співробітниками.

У D. melanogasterпараметри інтерсперсії різко відрізняються від видів з типом геному «ксенопус»: послідовності, що повторюються, довжиною 5600 п.н. чергуються з унікальними, довжина яких не менше ніж 13000 п.н.

Цікаво відзначити, що у домашньої мухигеном влаштований на кшталт «ксенопус». Цей факт прямо вказує на те, що в ході еволюції можливі дуже швидкі перетворення характеру чергування послідовностей та в еухроматичній частині геному. Птахи за параметрами інтерсперсії займають проміжне положення між типом "ксенопус" та типом "дрозофіла". Як показують результати досліджень останніх роківБагато видів тварин і рослин з організації геному не можуть бути суворо віднесені ні до того, ні до іншого типу. Так, у геномах ссавців зустрічаються довгі повтори – кілька тисяч пар нуклеотидів, у геномах лілейних до 90% ДНК може бути представлено повторюваними послідовностями. Наприклад, геном гороху не містить унікальних послідовностей, що перевищують за довжиною 300 п.н.

Інша особливість повторюваних послідовностей в геномах еукаріотів - інвертовані повтори, або паліндроми (див. нижче). У разі ренатурації вони майже миттєво формують дуплексні структури. По суті, паліндроми є частиною проміжних повторів. Однак деякі високочастотні повтори в еухроматичній частині геному, наприклад члени Alu-сімейств, можуть зустрічатися як у прямому, так і інвертованому положенні. Іноді між інвертованими повторами вклинюються інші послідовності.