Регуляция репликации днк. Репликация ДНК: учебное пособие

Главная

Советы

Репликация ДНК

Схематическое изображение процесса репликации: (1) запаздывающая нить, (2) лидирующая нить, (3) ДНК-полимераза, (4) ДНК-лигаза, (5) РНК-праймер, (6) праймаза, (7) фрагмент Оказаки, (8) ДНК-полимераза, (9) хеликаза, (10) одиночная нить со связанными белками, (11) топоизомераза.

Реплика́ция ДНК - процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15-20 различных белков, называемый реплисомой.

Репликация проходит в три этапа:

инициация репликации
элонгация
терминация репликации.

Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много.

Репликон - это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта.

Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка - место непосредственной репликации ДНК.

Суть репликации днк заключается в том, что специальный фермент разрывает слабые водородные связи, которые соединяют между собой нуклеотиды двух цепей. В результате цепи ДНК разъединяются, и из каждой цепи «торчат» свободные азотистые основания (возникновение так называемой вилки репликации). Особый фермент ДНК-полимераза начинает двигаться вдоль свободной цепи ДНК от 5"- к З"-концу (лидирующая цепь), помогая присоединиться свободным нуклеотидам, постоянно синтезируемым в клетке, к З"-концу вновь синтезируемой цепи ДНК. На второй нити ДНК (отстающая нить) новая ДНК образуется в виде небольших сегментов, состоящих из 1000-2000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки).

Для начала репликации ДНК фрагментов этой нити требуется синтез коротких фрагментов РНК как затравок, для чего используется особый фермент - РНК-полимераза (праймаза). Впоследствии праймеры РНК удаляются, в образовавшиеся бреши встраивается ДНК с помощью ДНК полимеразы I. Таким образом, каждая цепь ДНК используется как матрица или шаблон для построения комплементарной цепи.

Основные ферменты репликации ДНК:

ДНК - полимераза

ДНК-полимераза - фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов.

ДНК - лигазы

Лигаза - фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лиᴦᴎҏование). ДНК-лигазы -- ферменты, катализирующие ковалентное сшивание цеᴨȇй ДНК при репликации.

ДНК - хеликазы

ДНК хеликазы - ферменты раскручивающие двуцепочечную спираль ДНК.

ДНК-топоизомеразы

ДНК-топоизомеразы-ферменты, изменяющие стеᴨȇньсверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся ᴨȇред вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цеᴨȇй в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения.

Праймаза

Праймаза - фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.

Лекция 3. Репликация различных ДНК и ее регуляция и репарация

Уотсон и Крик предположили, что для удвоения ДНК должны произойти разрыв водородных связей, удерживающих вместе спиральный дуплекс, и расхождение цепей. Они также высказали мысль, что каждая цепь дуплекса служит матрицей при синтезе комплиментарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской. Уотсон и Крик предполагали, что репликация ДНК осуществляется спонтанно, без участия ферментов, но это оказалось неверно. Тем не менее идея о том, что удвоение ДНК происходит путем последовательного соединения нуклеотидов в соответствии с правилом комплиментарности, заданным каждой цепью спирали, разрешила концептуальную проблему точного воспроизведения генов.

С того времени как было высказано это предположение, матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными данными, полученными как in vitro так и in vivo для различных организмов. Согласно модели репликация всех двуцепочечных ДНК полуконсервативна. Доказательство полуконсервативного механизма было получено в 1958 г. учеными Мезельсоном и Сталь(ем). Сначала они выращивали бактерий длительное время на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (15 N), который включался в ДНК, а затем переносили их на среду, содержащую обычный легкий изотоп азота (14 N). После репликации дочернюю ДНК первого поколения фракционировали по плотности. Оказалось, что вся дочерняя ДНК однородна и имеет плотность, промежуточную между плотностью тяжелой и легкой ДНК. Следовательно, одна цепь молекулы дочерней ДНК содержала 15 N, а другая 14 N, что отвечает полуконсервативному механизму. Существуют ли в природе альтернативные способы репликации двуцепочечной ДНК (консервативный и дисперсный) – неизвестно. Итак, после одно раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних ДНК является родительской, т.е. консервативной, а другая – синтезированной заново.

Репликация одноцепочечной ДНК у вирусов. Если геном представлен одноцепочечной ДНК (как у некоторых вирусов), то эта единственная цепь служит матрицей для образования комплиментарной цепи, с которой она образует дуплекс, а затем на этом дуплексе синтезируются либо дочерние дуплексы, либо одноцепочечные копии одной их матричных цепей. Репликация генетического материала вируса осуществляет обычно с участием ферментов клетки-хозяина. На некоторых молекулах вирусной ДНК синтезируются также ее ДНК-копии – с помощью либо клеточной, либо кодируемой вирусом ДНК-полимеразы. Эти ДНК-копии используются в последствии при сборке вирусных частиц. Репликация ДНК вирусов происходит либо в ядре клетки-хозяина (вирус герпеса), либо в цитоплазме (поксвирусы).

Репликация у прокариот. Редупликацию ДНК (процесс, при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается с максимальной точностью дочерней ДНК) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3"-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3"-конца к 5"-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5"-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3"-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5"-углеродом дезоксирибозы. Следовательно, к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3"-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении 5"-3" . Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата - предшественника присоединяемого нуклеотида.

Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.

Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-полимераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 кДа, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.

Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизомеразы». (прозрачка 6) в точке начала репликации – ori (origin – начало репликации).

Структура точек начала репликации. Фрагменты ДНК, несущие точку начала репликации выделены из E.coli и некоторых плазмид, а также из дрожжей и ряда эукариотических вирусов. В некоторых случаях место начала репликации имеет такую нуклеотидную последовательность, что дуплекс принимает необычную конфигурацию, колторую распознают белки, участвующие в инициации. Природа взаимодействия между точкой начала репликации и белками и механизм инициации в целом исследованы мало.

Итак, топоизомераза продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимераза, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов - порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК - жирной.)

Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-полимераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему («танцует от печки»). Это - ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная - она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов - всего на 200 нуклеотидов).

Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».

Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...

Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК тандем геликаза-ДНК-связывающие белки - ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топоизомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а геликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» - по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место - ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией - около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).

Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5"-концу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3"- 5", считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).

Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», - ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные» дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед.

Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5"-3" экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.

рибонуклеаза Н

ДНК-полимеразаII

Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 - у животных и 20 - у растений.

Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1-2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме (см. ниже).

Более сложная модель движения репликативной вилки предполагает формирование реплисомы – мультиферментного комплекса более высокого уровня организации. Этот комплекс состоит из функционального праймосомо-праймазного комплекса, геликазы, полимеразы III, и, возможно, гиразы. Такой комплекс может обеспечивать удлинение лидирующей цепи и одновременно инициацию праймерной РНК, а также достраивание ДНК при синтезе отстающей цепи. Две реплисомы, работающие согласованно в двух вилках репликации, которые движутся в противоположных направлениях вдоль кольцевой хромосомы, сделали бы эту модель еще более изящной.

Репликация кольцевых дуплексов. Репликация инициируется также в точке начала репликации (ori).

Растущие цепи образуют репликативные вилки, пересещающиеся либо в двух (вверху), либо в одном (внизу) направлении в зависимости от природы точки начала репликации.

В некоторых кольцевых геномах в каждой цепи имеется своя точка начала репликации (например, в митохондриальной ДНК животных). Синтез одной цепи начинается в точке ori >R >. Когда новая цепь доходит до точки ori >D >, начинается синтез другой цепи. Синтез инициируется путем образования праймерной РНК.

Некоторые двуцепочечные кольцевые хромосомы реплицируются альтернативным способом, называемым репликацией по типу катящегося кольца. В этом случае двуцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца), и к образовавшемуся в результате надреза 3΄ - гидроксильному кольцу с помощью полимеразы III присоединяются нуклеотиды; при этом матрицей служит интактная замкнутая цепь. Таким образом в вилке синтезируется только лидирующая нить. По мере синтезалидирующей цепи происходит вытеснение 5΄-конца надрезанного кольца как одиночной цепи. В результате длина лидирующей цепи может превышать длину матрицы в 2-5 раз. Такой способ репликации используют фаги М13 или фX174 (их зрелые геномы одноцепочечные кольцевые ДНК)на поздних стадиях инфекционного процесса, после того как инфицирующая ДНК превращается в двуцепочечную кольцевую форму. Постоянно отделяющиеся одиночные цепи ДНК, образуемые при репликации по типу катящегося кольца, надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкаются с образованием зрелых форм, упаковываемых в вирусные частицы. Фаг λ использует такой способ репликации при образовании двуцепочечной линейной вирусной ДНК. Субстратной матрицей в этом случае является двуцепочечная кольцевая ДНК, которая была реплицирована после превращения на ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК в кольцевую репликативную форму.

Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: α, β, γ, δ, и ε. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза δ. ДНК-полимераза α отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза β - копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза γ ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы ε пока неизвестна.

Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек. Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы δ служат последовательности относительно слабо связанных А-Т пар оснований. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких независимо инициированных новосинтезированных цепей.

Теломеры и центромеры. Центомеры и теломеры – наиболее четко выраженные морфологические структуры хромосом (прозрачка 12). Долгое время считалось, что их строение и функции связаны с какими-то особенными последовательностями ДНК. Однако удалось выявить лишь одну такую особенность на молекулярном уровне: присутствие в области центромер и теломер сателлитной ДНК . Сателлитная ДНК – это длинные тандемные повторы, расположенные в области центромер и теломер.

Строение центромер . У млекопитающих центромеры имеют сложную дискообразную структуру, называемую кинетохором. С каждой стороны хромосомы располагается по одному кинетохорному диску. Во время митоза микротрубочки фибрилл веретена деления прикрепляются непосредственно к плотному наружнему слою кинетохора, связанному с петлями хроматина. Кинетохор у дрожжей образуют CEN-области (короткие сегменты ДНК) вместе с ДНК-связывающими белками (прозрачка 13). Последовательности, расположенные с одной или с обеих сторон от CEN-областей, могут блокировать прохождение репликационной вилки до появления специфического сигнала, разрешающего окончание репликации в анафазе.в таком случае число хромосом не будет превышать одной на дочернюю клетку.

Последовательности в области теломер. Теломеры –концы эукариотической хромосомы, являются также и концами линейного дуплекса ДНК. Именно с теломерами связана одна из проблем репликации: как достраиваются 5΄-концы хромосомного дуплекса, если ДНК-полимеразы не инициируют синтез новых цепей? Возможно, этот вопрос решается также как при репликации линейного дуплекса аденовирусов, или с помощью альтернативных механизмов? Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом – теломеры – реплицируются с помощью особого механизма. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных, растений и позвоночных имеют сходное строение: они содержат шпилькообразные структуры, в которых 3΄- и 5΄-концы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много тандемных повторов. Около петли в одной из цепей в области повторов имеются множественные одноцепочечные разрывы. Недавно из Tetrahymena был выделен фермент – теломераза – терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, которая присоединяет повтор 5΄-TTGGGG-3΄, последовательно по одному нуклеотиду, к 3΄-концам специфических олигонуклеотидных праймеров (TTGGGG) >n > (Tetrahymena ) и (TGTGTGGG) >n > (дрожжи). Таким образом, теломераза может строить теломеры при этом родительская ДНК не используется в качестве матрицы (ппрозрачка 20). Теломераза – это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс, а для проявления ферментативной активности требуется как РНК так и белки. Гипотетически схема образования теломеры представлена на рисунке. В верхней части рисунка представлено образование петли на конце цепи, содержащей последовательность 5΄-(TTGGGG) >n >-3΄, и одноцепочечных разрывов на противоположной цепи, содержащей последовательность 5΄-(CCCCAA) >n >-3΄. К 3΄-концу нижней цепи с помощью телоизомеразы присоединяются последовательно, по одному нуклеотиду, единицы 5΄- TTGGGG -3΄. Праймаза и ДНК-полимераза копируют 5΄- (TTGGGG) >n > -3΄-цепь с образование новых 5΄-(CCCCAA) >n >-3΄-единиц. В результате неполного лигирования в С-богатой цепи остаются одноцепочечные разрывы. На 3΄-конце 5΄-(TTGGGG) >n >-3΄-цепи вновь образуется петля, стабилизируемая взаимодействиями между остатками гуанозина.

Терминация репликации.

Терминация и расхождение в кольцевых геномах. Замкнутость структуры многих геномных ДНК упрощает процесс завершения репликации всей нуклеотидной последовательности. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепи вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3΄-гидрокси- и 5΄-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо – при двунаправленной репликации – в середине кольца (прозрачка 14). Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом они обычно оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные геномы. Это происходит с помощью топоизомеразы типа II (прозрачка 15).

Терминация и расхождение в линейных ДНК. За исключением аденовирусной ДНК, где синтезновых цепей ДНК инициируется белковым праймером и матричная цепь копируется полностью (прозрачка 16), во всех других случаях для репликации необходим РНК-праймер, что создает особые проблемы при завершении репликации линейной дуплексной ДНК (прозрачка 17). Дело в том, что после инициации синтеза новой цепи и последующего удаления РНК-праймера новосинтезированная цепь содержит пробел на 5΄-конце. Поскольку никаких способов удлинения 5΄-концов цепей ДНК ене существует, необходимы какие-то иные методы завершения репликации. Были предложены два способа .

Первый : предполагает, что существуют цепи ДНК с прямыми повторами на концах (прозрачка 18). После репликации два комплиментарных конца обоих незавершенных дуплексов могут спарится и образовать линейные конкатемеры с одноцепочечными разрывами.остающиеся пробелы могут быть заполнены путем удлинения цепей в направлении 3΄ →5΄ с последующим соединением их ДНК-лигазой либо путем прямого соединения стыкующихся концов с помощью ДНК-лигазы с образование конкатемеров. После надрезания конкатемера специфической эндонуклеазой образуются выступающие 5΄-концы, и ДНК-полимераза может наращивать более короткие цепи с 3΄-конца.

Второй. Предполагает наличие на конце каждой цепи ДНК коротких инвертированных повторов, благодаря которым образуются небольшие петли (прозрачка 19). 3΄-конец петли служит праймером для копирования нереплицированного участка. Благодаря специфическому разрыву в начале инвертированного повтора получается структура, которую можно достроить с 3΄-конца до восстановления исходной двуцепочечной концевой последовательности.

Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3"-5", - обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это - очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5-10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований.

Репарация ДНК

ДНК – это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять (репарировать) повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплиментарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации (см. ниже). Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двуцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.

Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N (депуринизация) при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации -–это ведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки Ц и А могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образование соответственно остатков У и гипоксантина; частота таких событий примерно 100 на геном – это ведет к появлению мутаций.

Многие изменения в структуре ДНК происходят под действием химических веществ, присутствующих в окружающей среде. Это алкилирующие агенты (азотистые соединения, алкилсульфонаты, нитрозомочевина), которые модифицируют предпочтительно Г-остатки, соединения, встраивающиеся между соседними парами оснований и приводящие к появлению вставок и делеций во время репликации; бифункциональные агенты, способные образовывать ковалентные сшивки между двумя цепями ДНК и блокировать их расхождение при репликации. Не менее разрушительны физические воздействия – поглощение Т или Ц УФ-света приводит к образованию циклобутановых димеров между соседними пиримидинами; ионизирующая радиация (космические лучи) способствует образованию высокореакционоспособных свободных радикалов, оказывающих на ДНКсамые разнообразные воздействия; рентгеновские лучи – вызывают в ДНК одно-и-двуцепочечные разрывы, а также другие повреждения, характерные для воздействия свободных радикалов.

Известны два основных способа репарационных процессов:

непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры;

удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ресинтез этого участка путем репликации.

репарация путем прямого восстановления исходной структуры.

Если под воздействием алкилирующих агентов – N-метил –N-нитрозомочевины или N 1 , N-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образовался О 6 - метил- или О 6 -алкилзамещенные гуаниновые остатки, то деалкилирование таких остатков идет при участии ферментов – О 6 -метилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы, которая катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Это у бактерий и млекопитающих.

Если при облучении ДНК УФ-светом образовались циклобутановые димеры между соседними парами пиримидиновых оснований, то осуществляется ферментативное (фотолиазы –нет у млекопитающих) превращение их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и используя энергию поглощенног им света разрушает димер без разрыва цепей ДНК.

Репарация путем замены модифицированных остатков.

Замена модифицированного нуклеотида обычно проходит в четыре этапа:

1 этап . Фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Выщепление сайтов, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация осуществляется ферментами АР (апуриновые, апиримидиновые)-эндонуклеазы. В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют ферменты – N-гликозилазы, расщепляющие гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоскирибозой (прозрачка 25)

2 этап . Экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь.

3 этап . Удаленный участок синтезируется заново с 3΄-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи.

4 этап . Концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи (прозрачка 26)

Значение репарации ДНК.

Устранение ошибок репликации важно, так как большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные если их не устранить, сохраняться в геноме потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Люди, страдающие, например, пигментной ксеродермой, очень чувствительны к УФ-свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию в RAD-генах, проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутауцией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека.как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.

Репликация происходит после прохождения клеткой точки рестрикции или START

Репликация регулируется поэтапно и скоординирована с наступлением митоза

Репликация происходит в точках инициации, которые могут обладать особой первичной структурой, специфическим положением, или располагаться в ДНК на определенных расстояниях

Инициация происходит только в разрешенных точках, способных к репликации

Осуществив свои функции, до наступления следующего цикла, точки начала репликации не могут использоваться повторно

Когда клетки проанализировали состояние окружающей среды и приняли решение вступить в цикл деления, они проходят точку G1/S и начинают репликацию ДНК. Как клетки объединяют и активируют факторы, необходимые для репликации ДНК? Какие механизмы контроля гарантируют, что клетка лишь однажды реплицировала ДНК, и только один раз в цикле?

Хотя пока невозможно дать полные ответы на эти вопросы , в результате идентификации и анализа последовательности дрожжевых хромосомных ДНК, способных к независимой репликации, было получено много информации о самом процессе репликации ДНК Эти последовательности в хромосоме, называемые автономно реплицирующиеся последовательности (ARS), являются частью точек начала репликации. Точка инициации или начала (ориджин репликации) представляет собой участок последовательности ДНК, на котором начинается репликация.

У почкующихся дрожжей, но не у большинства других организмов , точки начала репликации представлены небольшими консенсусными последовательностями. У сливающихся дрожжей эти точки занимают большие участки ДНК, богатые АД парами, но не отличаются какой-то особой структурой. У остальных эукариот точки начала репликации расположены случайно, в соответствии с распределением по геному белков, неспецифически связанных с ДНК.

Для того чтобы гарантировать своевременную дупликацию генома , на хромосоме должно быть достаточное количество точек начала репликации. У бактерий для репликации единственной кольцевой хромосомы необходима лишь одна точка начала, однако у эукариот, имеющих большой геном, распределенный по многим линейным хромосомам, должно быть много точек начала репликации. У почкующихся дрожжей, величина генома которых составляет около 13 Мб, в 16 хромосомах находится примерно 400 точек начала репликации.

Это создает несколько проблем, связанных с регуляцией процесса репликации . Функционирование точек начала репликации должно быть скоординировано с клеточным циклом таким образом, чтобы репликация начиналась только в течение S фазы. Должна быть полная уверенность в том, что репликация завершилась до перехода клетки в митоз. Каждая из точек начала репликации должна функционировать только один раз, с тем чтобы гарантировать, что ДНК реплицируется лишь один раз за цикл.

В продолжение всего клеточного цикла 0RC связан с точкой начала репликации на хромосоме.
В течение короткого промежутка времени, от поздего митоза до G1, с точкой начала также связываются белки, активирующие репликацию,
Cdc6 и Cdt1, что, в свою очередь, активирует гексамерный МСМ геликазный комплекс (МСМ2-7).
Этот этап завершает снятие блока репликации и сборку пре-RC.

Точки начала репликации связывают факторы, необходимые для активации репликации и инициации синтеза ДНК. Инициация репликации ДНК происходит только в тех точках, которые содержат связанные факторы и которые поэтому относятся к разрешенным точкам. Однако в каждом раунде репликации ДНК в процессе участвует ограниченный набор потенциальных начальных точек, присутствующих в хромосомах. Более того, по мере активации в разное время различных разрешенных начальных точек, события инициации также происходят через различные интервалы времени. Например, некоторые точки активируются в ранней S-фазе, а другие переходят в это состояние позже.

Неизвестно, чем задается этот временной фактор , но похоже, что расположение специфической точки начала репликации на хромосоме определяет время ее наступления.

Ддя того чтобы репликация началась, в точке начала должен сформироваться пререпликативный комплекс (pre-RC). В результате проведения генетических исследований на дрожжах и биохимических экспрериментов на экстрактах яйцеклеток Xenopus, выяснилась картина сборки pre-RC. Процесс начинается со связывания с ДНК комплекса из шести белков, который носит название комплекса, распознающего область начала репликации (origin recognition complex, ORC). Этот комплекс помечает потенциальную точку начала репликации, однако его недостаточно для активации. Он служит платформой для связывания еще двух консервативных белков: Cdc6, который относится к семейству ААА+АТФазы, и Cdt1. (Многие белки, обладающие АТФазным доменом, для выполнения работы используют энергию АТФ.)

Затем к ним присоединяется комплекс поддерживающий минихромосому (minichromosome maintenance complex, МСМ), представляющий собой кольцевую структуру, состоящую из шести родственных белков, которые также относятся к большому семейству ААА+АТФаз. Комплексы МСМ присутствуют в избытке и распространяются за пределы точки начала репликации. После присоединения МСМ, ORC и Cdc6 становятся необязательными компонентами и pre-RC переходит в состояние способное к активации. Порядок событий, происходящих при сборке pre-RC в точках начала репликации, схематически представлен на рисунке ниже.

Сборка pre-RC ограничена промежутком между концом М-фазы и ранней S-фазой, что объясняется следующими причинами. Во-первых, в клетке уровень белка Cdc6 контролируется таким образом, что он присутствует только в этот промежуток времени. В отсутствие белка Cdc6, МСМ белок не связывается с точкой начала репликации. Во-вторых, у Метазоа, белок Cdt1 негативно регулируется другим белком, геминином, который блокирует его активность во всех периодах, за исключением окна в G1. Наконец, сборка самого pre-RC ограничивается активностью митотического CDK-циклинового комплекса.

Субстратами для этого комплекса являются субъединицы ORC , Cdc6 и МСМ . При фосфорилировании Cdc6 инактивируется, а фосфорилирование белка МСМ в S-фазе вызывает его отщепление от ДНК. Поэтому pre-RC может сформироваться только при низкой активности CDK-циклинового комплекса. Это характерно для промежутка между уровнями высокой активности митотического комплекса CDK-циклина в М-фазе, и в S-фазе, когда она снова увеличивается, способствуя активации точки начала репликации.

Каким образом точка начала репликации переходит из пререпликативного в репликативное состояние? Для такого перехода необходимо формирование многих дополнительных белковых комплексов, и процесс находится под контролем двух киназ, комплекса CDK-циклин и Cdc7-Dbf4 (DDK). Таким образом, активность CDK-циклинового комплекса координирует процессы репликации и клеточного цикла. При этом координация может носить как негативный (предотвращая сборку pre-RC и, таким образом, повторное функционирование точек начала репликации), так и позитивный характер (промотируя активацию точек начала репликации). К числу вопросов, ожидающих своего ответа, относится вопрос относительно субстратов киназ, промотирующих инициацию репликации.

Если комплексы CDK-циклин обеспечивают координацию процессов во всем цикле, то DDK действует на уровне отдельных точек, инициирующих синтез ДНК. К числу наиболее известных субстратов этой киназы относятся сами МСМ-белки. Интересно, что точечная мутация в гене Mcm5 отменяет необходимость присутствия DDK. Это позволяет предполагать, что фосфорилирование приводит к изменению струтуры белка МСМ, что служит причиной инициации репликации. Впрочем, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что эти изменения крайне незначительны. На показаны контрольные процессы репликации ДНК с участием CDK и DDK.

Вероятно, лимитирующим процессом инициации репликации в отдельных начальных точках является связывание белка Cdc45, для которого необходимы как CDK-циклиновый комплекс, так и DDK. Связывание этого белка, которое сопровождается образованием дополнительного комплекса, называемого GINS, приводит к раскручиванию спирали ДНК в начальной точке, за счет активации комплекса МСМ, действующего как хеликаза. Таким образом, МСМ превращается из фактора сборки, участвующего в формировании pre-RC, в фермент хеликазу, который является частью комплекса элонгации. Раскручивание двойной спирали ДНК в точке начала репликации приводит к образованию однонитевой ДНК, которая связывает специфический белок RPA, относящийся к группе белков, связывающихся с однонитевой ДНК (ssDNA binding proteins).

В свою очередь, белок RPA способствует связыванию комплекса праймаза/ДНК-полимераза альфа, который инициирует синтез ДНК. Комплекс МСМ и Cdc45 движется вдоль ДНК, формируя расширяющуюся репликативную вилку, которая образует большую реплисому, включающую в основном ДНК-полимеразу 6, а не полимеразу а. Процессы инициации репликации ДНК представлены на рисунке ниже. В поддержании функционирования реплисомы и защите ДНК в области репликативной вилки от повреждений участвуют контрольные точки и системы репарации ДНК.

Как только МСМ отошли от точки начала репликации, она считается «использованной» и не может активироваться повторно до окончания следующей М-фазы, пока в начальной точке снова не сформируется pre-RC. По мере прохождения S-фазы, МСМ удаляются из хроматина. Наряду с этим, при движении репликативной вилки устанавливаются связи, соединяющие вместе до наступления митоза вновь образованные сестринские хроматиды. Таким образом, завершение S-фазы связано с формированием структур, необходимых для правильной сегрегации хромосом в митозе, что свидетельствует об образовании связей между различными фазами клеточного цикла.

Функция точек начала репликации также регулируется на уровне целой хромосомы . Целесообразно напомнить, что в клетке с помощью нуклеосом упакована в хроматин, который накладывает на нее ряд структурных ограничений. Это обстоятельство может влиять на временную организацию репликации; например не на всех точках начала в S-фазе репликация происходит в одно и то же время. В некоторых случаях относительное время наступления активации точек начала репликации может определяться не самой точкой, а ее расположением на хромосоме. Точки, расположенные поблизости от транскрипционно-активного эухроматина, инициируются раньше, чем расположенные вблизи транскрипционно-неактивного гетерохроматина, которые обычно инициируются в поздней S-фазе.

Лекция 3. Репликация различных ДНК и ее регуляция и репарация

Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».

Подробное рассмотрение молекулярных механизмов регуляции репликации ДНК выходит за рамки книги, поэтому ограничимся несколькими замечаниями по данному вопросу и более детально обсудим лишь механизм регуляции репликации у E. coli, в том числе и бактериальных плазмид, что имеет непосредственное отношение к функционированию плазмидных векторов в бактериальных клетках.

Синтез ДНК тесно связан с другими процессами, подготавливающими деление клеток, так как передача необходимой генетической информации родительских клеток дочерним является для клеток-потомков жизненно важной. Наличие избыточной генетической информации отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток, тогда как недостаток ее, возникающий вследствие недорепликации ДНК, приводит к летальному эффекту из-за отсутствия жизненно важных генов. Однако процесс передачи генетической информации от родительских клеток дочерним у эукариот не ограничивается простой редупликацией ДНК хромосом. Так, для насекомых многих видов характерно наличие гигантских политенных хромосом, которые возникают в результате множественных раундов репликации ДНК исходных хроматид, не сопровождающейся их расхождением.

Политенизация хромосом представляет обширный класс генетических явлений, связанных с избирательной избыточной репликацией (мультипликацией ) или недорепликацией отдельных генетических локусов эукариот. Ярким примером такого рода является изменение числа генов рибосомных РНК у животных. Амплификация генов рРНК в ооцитах амфибий происходит путем образования их внехромосомных (экстрахромосомных) копий в виде кольцевых молекул рибосомных (р) ДНК, которые далее реплицируются по механизму "катящегося кольца". При этом в каждой клетке амплифицируется только по одному из сотен повторов рДНК, так что амплификация рДНК на одном повторе каким-то образом подавляет процесс амплификации на других, и все образовавшиеся повторы одного ооцита идентичны, но отличаются от наборов амплифицированных рДНК других ооцитов. Строгая стадие- и тканеспецифичность, а также избирательная амплификация только одного повтора рДНК указывают на наличие тонких регуляторных механизмов процесса репликации и в этом случае.

Характерными примерами возрастания числа генов вследствие их избирательной репликации являются магнификация генов рРНК и изменение числа генов, определяющих устойчивость клеток к лекарственным препаратам. В первом случае утрата части генов рРНК у дрозофилы в результате делеции сопровождается постепенным восстановлением их числа, тогда как во втором случае у клеток, находящихся в условиях селективного действия токсичного для них лекарственного препарата, возрастает число копий генов, необходимых для его нейтрализации. В частности, это характерно для гена дигидрофолатредуктазы в присутствии метотрексата. Высказывается предположение, что в основе изменения числа копий таких генов лежит механизм неравного кроссинговера.

Репликация хромосом бактерий тесно сопряжена с метаболизмом клеток. Например, частота инициаций новых раундов репликации зависит от скорости роста бактериальных клеток, и в клетках быстро растущих бактерий могут содержаться хромосомы с несколькими работающими репликативными вилками, хотя для репликации одной бактериальной хромосомы их требуется только две, инициированные в единственной области начала репликации (ori) и расходящиеся в противоположных направлениях. Это позволяет бактериям при благоприятных условиях затратить для генерации меньше времени, чем для полной репликации бактериальной хромосомы. Очевидно, что для поддержания строго упорядоченного характера репликации должны существовать тонкие механизмы регуляции репликации на уровне инициации новых раундов. Такие механизмы, действительно, существуют.

Наиболее хорошо изученными в настоящее время являются механизмы регуляции синтеза ДНК у E. coli, в том числе механизмы контроля числа копий у небольшой плазмиды E. coli ColE1, которые будут рассмотрены ниже более подробно из-за важности этих явлений для генной инженерии.

4.2.1.Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция

Репликация хромосомной ДНК у бактерий играет ключевую роль в их жизненном цикле. В ходе этого процесса микроорганизмы редуплицируют свой геном, а образовавшиеся дочерние геномы далее переходят в дочерние клетки. Высокая точность, с которой бактерии осуществляют такие процессы, указывает на наличие специальных механизмов их координации и контроля.

Структура области начала репликации oriC . Хромосома E. coli содержит единственную область начала репликации (origin), названную oriC , на которой происходит инициация репликации (рис. I.47,а ). Размер минимальной области начала репликации, обеспечивающей автономную репликацию хромосомы, составляет 258 п.о. (положение 11–268 на рис. I.47). Сравнение первичных структур областей начала репликации различных энтеробактерий показало, что их последовательности представлены короткими консервативными участками, которые перемежаются дивергировавшими сегментами ДНК, длины которых, однако, высококонсервативны. Консервативные участки оказались сайтами связывания регуляторных белков, разделенных спейсерными последовательностями. OriC содержит пять консенсусных 9-нуклеотидных сайтов связывания инициатора DnaA (непалиндромные повторы), названных DnaA-боксами. У всех энтеробактерий области начала репликации содержат 9–14 сайтов GATC, положение восьми из которых консервативно.

В левой части oriC находится AT-богатая область, содержащая три похожих последовательности длиной в 13 нуклеотидов, каждая из которых начинается с GATC. Здесь же локализован AT-кластер, который вместе с левой 13-нуклеотидной последовательностью образует область нестабильной спирали ДНК (ДНК-расплетающий элемент ). Этот участок ДНК может быть заменен без потери функции на аналогичный по нуклеотидному составу, но с другой последовательностью нуклеотидов.

OriC содержит сайты связывания белков, изгибающих ДНК, IHF (integration host factor) и FIS (factor for inversion stimulation). Оба белка, по-видимому, помогают инициатору DnaA раскручивать ДНК.

Димерный белок IciA, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 33 кДа, специфически связывается с AT-богатыми 13-мерными повторами. Функция этого белка неизвестна, так же как и функция белка Rob, который специфически взаимодействует с 26-нуклеотидным сайтом в правой части DnaA-бокса R4. ДНК вблизи Rob-сайта обнаруживает изгиб, который более ярко выражен у молекул, полностью метилированных Dam-метилтрансферазой (см. ниже). С такими полностью метилированными ДНК взаимодействует гистоноподобный белок H-NS, сайт связывания которого перекрывается с Rob-сайтом. Это взаимодействие оказывает влияние на функционирование oriC .

Рис. I.47. Структура области начала репликации хромосомы E. coli (а ) и схема инициации ее репликации (б )

HobH – белок, взаимодействующий с метилированной по одной цепи ДНК области начала репликации (hemimethylated origin binding)

Функции белка DnaA. Белок DnaA играет ключевую роль в сборке реплисомы – многокомпонентного белкового комплекса, осуществляющего двунаправленный синтез ДНК. Белок распознает область начала репликации и привлекает к месту сборки остальные белковые компоненты реплисомы.

Этапы инициации синтеза ДНК на oriC . Сборка исходного комплекса начинается с взаимодействия белка DnaA с DnaA-боксами R1–R4 и M (см. рис. I.47,б ). Для успешного прохождения последующих этапов сборки реплисомы белок DnaA должен находиться в комплексе с ATP и взаимодействовать с сверхспирализованным oriC. С помощью электронного микроскопа исходный комплекс обнаруживается в виде компактной эллипсоидной структуры, содержащей 20 мономеров DnaA, которая закрывает oriC. Исходный комплекс обладает высокоупорядоченной структурой.

В присутствии ATP в высокой концентрации (5 мМ) исходный комплекс превращается в открытый комплекс . В этом комплексе происходит частичное расплетение АТ-богатых 13-нуклеотидных повторов, расположенных в левой части oriC . При 37 ° или выше единственный белок DnaA может обеспечивать расплетение ДНК. Для образования открытого комплекса при более низких температурах требуется участие структурирующего белка HU или интеграционного фактора бактерии-хозяина IHF. В открытом комплексе обнаруживают небольшие участки расплетенной ДНК в правой части oriC между DnaA-боксами R2 и R4, которые рассматривают как места посадки хеликазы.

Белок DnaB является хеликазой репликативной вилки и входит в открытый комплекс с образованием препраймирующего комплекса I , взаимодействуя с одноцепочечными участками частично расплетенной ДНК. Такие участки подготавливаются белком DnaA, который вытесняет SSB-белок с соответствующих сайтов. DnaB входит в препраймирующий комплекс I в виде гексамеров, образовавших комплекс с шестью мономерами DnaC, каждый из которых связывает одну молекулу ATP. В этом комплексе хеликазная активность белка DnaB блокирована. Освобождение DnaC из комплекса происходит в результате гидролиза ATP. Следствием этого является активация хеликазы DnaB и ее правильное расположение в комплексе. Совокупность этих событий превращает препраймирующий комплекс I в препраймирующий комплекс II .

Хеликаза должна начать функционировать в месте старта репликативной вилки в правой части oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4. Для этого она должна быть транслоцирована от места ее первоначального вхождения в комплекс к точке начала репликации. Предполагается, что транслокация ассоциирована с ATP-зависимым освобождением из комплекса белка DnaC, что сопровождается активацией хеликазы.

В праймирующем комплексе хеликаза DnaB взаимодействует с DnaG-праймазой, которая играет ключевую роль в обеспечении инициации репликации именно на oriC . Оба этих фермента обеспечивают сопряжение функционирования двух репликативных вилок, движущихся в противоположные стороны. В бесклеточной системе при низких концентрациях праймазы репликация становится однонаправленной и может инициироваться не на oriC . В праймирующем комплексе присутствие белка DnaA больше не требуется, и он после освобождения из комплекса может быть повторно использован для инициации репликации на другом oriC . Полагают, что во время координированной сборки двух репликативных вилок в одной из них синтезируется праймер, который становится затравкой при синтезе ведущей цепи другой репликативной вилкой, движущейся в противоположном направлении. Праймаза в праймирующем комплексе функционирует по дистрибутивному механизму. После синтеза праймеров она покидает репликативную вилку и заменяется новой молекулой праймазы во время образования очередного фрагмента Оказаки.

При образовании реплисомы в каждой репликативной вилке происходит ATP-зависимое формирование димерного комплекса холофермента ДНК-полимеразы III, связанного с 3"-концами праймеров (скользящий зажим, см. выше). Вслед за этим происходит координированная элонгация праймеров, сопровождаемая двунаправленным синтезом ведущих и отстающих цепей ДНК. В бесклеточной системе точки начала синтеза ведущих цепей локализованы в oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4.

Механизмы контроля инициации репликации in vivo. Инициация репликации ДНК у E. coli регулируется, по крайней мере, на трех уровнях: 1) инициация синхронизирована с клеточным циклом; 2) синтез ДНК в каждой области начала репликации в клеточном цикле инициируется только один раз; 3) инициация происходит синхронно во всех областях начала репликации, присутствующих в данной бактериальной клетке. Установлено, что синтез ДНК начинается после того, как масса бактериальной клетки в расчете на одну область начала репликации достигает определенного значения, названного массой инициации (initiation mass). В качестве основного водителя ритма (пейсмекера), играющего ключевую роль в контроле инициации репликации, в настоящее время рассматривается белок DnaA.

Подавление синтеза белка in vivo сопровождается завершением уже инициированного синтеза ДНК на фоне прекращения новых раундов инициации. Возобновление синтеза белка приводит к инициации репликации после лаг-периода в одну клеточную генерацию. При наличии всех необходимых белков инициация чувствительна к рифампину – специфическому ингибитору бактериальной РНК-полимеразы, что указывает на зависимость инициации от синтеза нетранслируемой РНК.

Роль топологии oriC в инициации репликации . Топоизомераза I и топоизомераза II (ДНК-гираза) поддерживают бактериальную хромосому в негативно суперскрученном состоянии. Приблизительно половина супервитков нейтрализуется гистоноподобными белками HU, IHF и FIS, тогда как остающаяся сверхспирализация бактериальной хромосомы облегчает транскрипцию, репликацию и сайт-специфическую рекомбинацию. Предполагается, что бактериальная хромосома состоит из 40–50 суперскрученных доменов с 25 супервитками на 1 т.п.о. ДНК. В настоящее время отсутствуют точные данные о топологическом состоянии oriC , необходимом для инициации репликации у E. coli. Известно, что мутации в гене топоизомеразы topA супрессируют температурно-чувствительные мутации dnaA(Ts) . Предполагается, что в этих мутантных штаммах топология oriC изменена таким образом, что допускает инициацию репликации при меньших внутриклеточных концентрациях белка DnaA. Кроме того, на важность определенного топологического состояния oriC для инициации указывает факт нарушения инициации у мутантных бактерий с измененным геном gyrB(Ts) , кодирующим B-субъединицу ДНК-гиразы.

Активация репликации транскрипцией. В том случае, если сверхспирализация минихромосом или плазмид, содержащих oriC , недостаточна для инициации их репликации, инициация может происходить при одновременной транскрипции ДНК в окрестностях oriC . Изменение топологии oriC в этом случае может осуществляться за счет образования R-петель (ДНК–РНК-гибрида в двухцепочечной ДНК) или вследствие транскрипции, как таковой, при которой перед транскрибирующей РНК-полимеразой имеет место локальная положительная сверхспирализация ДНК, а вслед за ней – отрицательная. Это облегчает образование открытых комплексов при инициации синтеза ДНК.

Роль белка DnaA в регуляции инициации репликации. ~60 минут необходимо бактерии для репликации хромосомной ДНК, разделения дочерних хромосом и подготовки к новому делению. Следовательно, клетки со временем генерации короче этого периода (например при повышенных температурах на богатых питательных средах) должны инициировать репликацию хромосом, предназначенных для последующих делений, до завершения предыдущего раунда репликации. Таким образом, в отдельной клетке может содержаться реплицирующаяся хромосома со множественными точками начала репликации. При этом инициация репликации на множественных областях начала репликации происходит одновременно.

Сверхпродукция DnaA в бактериях приводит к резкому возрастанию частоты инициаций репликации без изменения общей скорости синтеза ДНК, что указывает на DnaA как на позитивный регулятор этого процесса. Среди моделей, объясняющих механизм регуляторного действия белка DnaA наибольшее распространение получила модель титрования DnaA. В соответствии с этой моделью весь вновь синтезируемый белок DnaA связывается (титруется) DnaA-боксами oriC хромосомы. Как только количество молекул инициатора превышает число внутриклеточных DnaA-боксов (все DnaA-боксы оказываются занятыми белком), происходит инициация синтеза ДНК. После запуска инициации на одном oriC наблюдается освобождение молекул DnaA, резкое повышение его внутриклеточной концентрации и синхронная инициация синтеза ДНК на других доступных областях начала репликации. При этом ассоциация с мембранами первой oriC защищает ее от использования в реинициации.

Роль Dam-метилирования в инициации синтеза ДНК. Как уже упоминалось выше, Dam-метилтрансфераза E. coli модифицирует остатки аденина в последовательностях 5"-GATC. В результате репликации молекула ДНК временно превращается из полностью метилированной молекулы в метилированную по одной цепи, что позволяет клетке распознавать вновь синтезированную ДНК. Расположение кластеров Dam-сайтов в oriC энтеробактерий высококонсервативно (см. рис. I.47,а ). Неметилированная или наполовину метилированная плазмидная ДНК в клетках dam-мутантов не реплицируется, хотя и служит субстратом в бесклеточной системе репликации. Репликация хромосомной ДНК у dam-мутантов начинается на oriC , однако контроль репликации нарушен, что проявляется в асинхронности репликации на множественных oriC. Оказалось, что лишь наполовину метилированная, но не полностью метилированная или неметилированная oriC- ДНК специфически связывается с фракцией мембран E. coli in vitro. При этом в быстро растущих клетках 1/3 времени генерации oriC- ДНК находится в наполовину метилированном состоянии, после чего полностью метилируется. То же самое характерно и для промотора гена инициатора DnaA, у которого метилированное наполовину состояние связано с подавлением транскрипции гена. В отличие от этого реметилирование вновь синтезированной цепи ДНК остальной части бактериальной хромосомы происходит быстро – в течение 1–2 мин. На основании такого рода данных высказывается предположение, что в не полностью метилированном состоянии вышеупомянутые последовательности экранированы бактериальными мембранами от контактов с регуляторными белками и не могут участвовать в повторном раунде инициации репликации (период эклипса ). Мутации в гене seqA резко уменьшают время эклипса, что проявляется в асинхронности инициаций репликации. Белок SeqA оказался негативным регулятором инициации репликации, действующим на этапе взаимодействия oriC с бактериальными мембранами.

Роль белка SeqA в регуляции репликации бактериальных хромосом. Ген seqA кодирует белок длиной в 181 аминокислотный остаток, инактивация которого летальна для бактериальных клеток. Исследование взаимодействия этого белка с неметилированной, частично и полностью метилированной областями начала репликации методом смещения полос при электрофорезе в полиакриламидном геле показало его предпочтительное связывание с частично метилированными последовательностями. Однако для полной (контекст-зависимой) специфичности его взаимодействия требуется присутствие дополнительных факторов. Действительно, в составе ДНК-белковых комплексов, образованных с участием частично метилированных последовательностей oriC , обнаружен белок с молекулярной массой 24 кДа, который специфически взаимодействует с метилированной цепью ДНК в oriC . Скрининг клонотеки последовательностей E. coli позволил клонировать ген hobH (hemimethylated origin binding), кодирующий этот белок. Мутации по данному гену приводили к частичной утрате бактериальными клетками синхронизации в инициациях репликации, что также косвенно указывает на участие белка HobH в регуляции инициации репликации бактериальных хромосом на ранних стадиях клеточного цикла. Однако истинная роль этого белка в репликации окончательно не известна.

Период эклипса может заканчиваться в результате постепенного завершения метилирования частично метилированной последовательности oriC , находящейся в комплексе с мембранами. Полное метилирование этих последовательностей предотвращает их взаимодействие с мембранами и делает доступными для инициатора DnaA.

Терминация репликации. Встреча двух репликативных вилок в конце цикла репликации бактериальной хромосомы сопровождается несколькими событиями, которые необходимы для полного разделения двух образовавшихся бактериальных хромосом до деления клетки. Движение репликативных вилок навстречу друг другу сопровождается гомологичной рекомбинацией между дочерними хроматидами. В том случае, если количество произошедших рекомбинаций нечетное, образуется димер бактериальной хромосомы, тогда как при четном числе рекомбинаций – две катенированные (зацепленные друг за друга) хромосомы. Во втором случае разделение катенанов с помощью топоизомеразы IV приводит к полному разделению дочерних хромосом, тогда как в случае димера бактериальной хромосомы этого недостаточно. Разделение димера с образованием мономеров происходит в результате сайт-специфической рекомбинации в локусе dif под действием резольвазы (сайт-специфической рекомбиназы) XerCD.

4.2.2.Регуляция репликации плазмиды ColE1

Многие клетки прокариот в дополнение к основной хромосоме содержат небольшие внехромосомные ДНК, называемые плазмидами . Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч пар оснований, а число копий на клетку – от одной до нескольких сотен, способны к автономной (независимой от основной хромосомы) репликации и стабильно наследуются в ряду клеточных поколений. Хотя многие плазмиды дают клеткам-хозяевам ощутимые селективные преимущества (устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.п.), большинство из них являются криптическими , т.е. не проявляющимися в видимом фенотипе клеток. Поскольку их существование – это весомая нагрузка на метаболизм клеток-хозяев, остается непонятным смысл их эволюционной стабильности. Несмотря на то что в природных условиях бактериальные клетки, по-видимому, не испытывают давления отбора, направленного на сохранение плазмид внутри клеток, последние с помощью тонких механизмов, регулирующих число их копий в клетках, стабильно сегрегируют между дочерними бактериальными клетками.

Область начала репликации небольшой плазмиды ColE1, несущей гены устойчивости к колицинам, традиционно используется в генной инженерии при конструировании векторных молекул ДНК, которые находят применение для клонирования и экспрессии в клетках E. coli коротких последовательностей нуклеотидов. Именно поэтому целесообразно рассмотреть механизмы контроля репликации плазмиды ColE1.

Инициация репликации плазмиды ColE1. Репликация плазмиды ColE1 происходит в одном направлении (однонаправленная репликация) с использованием репликативного аппарата клетки-хозяина. Сама по себе плазмида не кодирует ни одного фермента, который требовался бы для ее репликации. Область начала репликации содержит два промотора, один из них обеспечивает синтез РНК-праймера (РНК II), необходимого для инициации репликации плазмиды. Синтезированная РНК II, длина которой зависит от типа реплицируемой плазмиды, далее подвергается процессингу с помощью РНКазы H с образованием РНК длиной в 550 нуклеотидов. Эта молекула эффективно используется ДНК-полимеразой I в качестве праймера при синтезе ведущей цепи ДНК. В отсутствие РНКазы H затравкой во время репликации служит 3’-конец РНК II, хотя и с меньшей эффективностью. В клетках, дефектных по РНКазе H и ДНК-полимеразе, инициация репликации ColE1 осуществляется ДНК-полимеразой III с участием РНК II по механизму, подробно рассмотренному выше.

Все три механизма инициации репликации плазмиды основаны на уникальном свойстве РНК II образовывать стабильный ДНК–РНК-гибрид в области начала репликации. Действительно, обычные транскрипты освобождаются из транскрипционного комплекса после завершения транскрипции и отделения РНК-полимеразы от матрицы, чего не происходит с РНК II. Анализ мутантов плазмиды, дефектных по репликации, а также их ревертантов показал, что в стабильном гибриде РНК II с матрицей происходит взаимодействие между G-богатой петлей РНК II, образованной 265 нуклеотидами выше точки инициации репликации (положение –265), и С-богатым участком ДНК, расположенным в окрестностях нуклеотида –20 (рис. I.48,а ). Обе эти последовательности оказались консервативными у родственных плазмид pMB1, p15A и KSF1030. Взаимодействия между указанными последовательностями, по-видимому, происходят в тот момент, когда РНК-полимераза еще находится в транскрипционном комплексе и цепи ДНК в окрестностях комплекса расплетены. Равновесие между двумя альтернативными конформациями РНК II является критическим в определении доли молекул РНК, остающейся в ДНК–РНК-гибриде, необходимом для инициации репликации плазмиды. Выбор между двумя альтернативными конформациями РНК II определяется первичной структурой участка, расположенного между нуклеотидами –359 и –380 (последовательность ) (см. рис. I.48,б ). Эта последовательность может взаимодействовать с выше расположенной комплементарной последовательностью  (структура ) или с гомологичной последовательностью , расположенной ниже (структура ). После того как РНК-полимераза транскрибирует первые 200 нуклеотидов, образовавшаяся РНК II формирует временную вторичную структуру, для которой характерно наличие трех доменов типа "стебель–петля" (I, II и III). Удлинение РНК II еще на несколько нуклеотидов приводит к разрушению стебля III и образованию стебля IV, который стабилизируется в результате комплементарных взаимодействий между последовательностями  и . В течение последующей элонгации РНК II у нее возникают две альтернативные возможности формировать свою вторичную структуру. Выбор в пользу той или иной конформации зависит от того, останется ли последовательность  связанной с последовательностью  или же образует новые контакты с -последовательностью. Переход от комплементарных пар  к  сопровождается сильными изменениями конформации РНК II, которые в конечном счете определяют ее способность служить праймером при репликации плазмиды. Молекулы РНК II в конформации  могут образовывать РНК–ДНК-гибрид, служащий субстратом для РНКазы H, а в конформации  такой способностью не обладают. Предложенная модель подтверждается, прежде всего, тем, что мутации, делающие предпочтительным образование конформации  из-за дестабилизации стебля IV, затрудняют функционирование РНК II в качестве праймера и приводят к понижению числа копий плазмиды ColE1 внутри бактериальных клеток. Такие мутантные плазмиды, дефектные по репликации, активизируются в результате супрессорных мутаций, стабилизирующих стебель IV. Таким образом, инициация репликации плазмиды ColE1 зависит от способности РНК II образовывать РНК–ДНК-гибрид вблизи точки начала репликации (ori). При этом на образование гибрида оказывают влияние вторичная и третичная структуры выше расположенной последовательности нуклеотидов предшественника праймера.

Рис. I.48. Схема регуляции репликации плазмиды ColE1

а – предполагаемая вторичная структура РНК II, после транскрибирования РНК-полимеразой  500 нуклеотидов ДНК плазмиды; дальнейшее удлинение РНК II сопровождается образованием ДНК–РНК-гибрида (жирная стрелка) между РНК II и транскрибируемой ДНК;

б – возможный механизм контроля репликации плазмиды. В верхней части рисунка изображена генетическая карта участка ДНК, необходимого для инициации репликации плазмидной ДНК и ее контроля. Схематически представлены пространственные структуры двух ингибиторов репликации плазмиды: РНК I и белка Rop. В нижней части изображены две альтернативные конформации РНК II, образующиеся под действием РНК I, I–X – элементы вторичной структуры

Контроль числа копий плазмиды ColE1. Контроль инициации репликации плазмиды ColE1 осуществляется главным образом на уровне изменения пространственной структуры РНК II. Поскольку плазмиды контролируют собственный биосинтез, т.е. их репликация проходит по аутокаталитическому механизму, было постулировано, что инициация репликации ColE1 находится под влиянием ингибитора, кодируемого плазмидой, концентрация которого в клетке тем выше, чем больше число внутриклеточных копий плазмиды. Действительно, анализ механизмов репликации мутантных плазмид, для которых характерна высокая копийность, позволил выявить два транс- действующих фактора, кодируемых плазмидой и оказывающих влияние на репликацию плазмиды in vivo.

Основным ингибитором репликации оказалась небольшая РНК длиной в 108 нуклеотидов, названная РНК I, полностью комплементарная 5’-концевой последовательности предшественника праймера (РНК II). Промотор гена РНК I расположен в области начала репликации плазмиды ColE1 и направлен в противоположную сторону по отношению к промотору РНК II (см. рис. I.48). Комплементарные взаимодействия между РНК I и РНК II оказывают влияние на образование пространственной структуры РНК II таким образом, что предпочтительно возникает конформация βγ, неактивная в отношении инициации репликации (см. рис. I.48,б , внизу справа).

Взаимодействие между РНК I и РНК II происходит продуктивно лишь до тех пор, пока синтезируется короткий транскрипт РНК II длиной не более 80 нуклеотидов. Хотя взаимодействие РНК I с такой короткой последовательностью нуклеотидов происходит медленнее, чем с транскриптом длиной в 360 нуклеотидов, в последнем случае РНК I не оказывает влияния на конформацию 5’-концевой части РНК II и на ее способность функционировать в качестве затравки при репликации плазмиды (конформация αβ, рис. I.48,б , внизу слева). Из этого ясно, что скорость образования гибридов между РНК I и РНК II является определяющей для эффективного функционирования механизма регуляции репликации плазмиды. Процесс взаимодействия РНК I и РНК II в настоящее время детально изучен. Он проходит через образование нескольких промежуточных продуктов и завершается получением стабильного гибрида между полностью комплементарными друг другу РНК I и 5’-концевой областью РНК II.

РНК-организующий белок Rop. Ген второго компонента, негативно регулирующего репликацию плазмиды ColE1, картирован непосредственно за областью начала репликации. Этот ген кодирует 63-звенный белок, названный Rop (repressor of primer), существующий в растворе в виде димера. Как in vivo, так и in vitro Rop усиливает ингибирующую активность РНК I, не оказывая влияния на синтез РНК II. При этом Rop влияет на начальные фазы взаимодействия РНК I и РНК II, облегчая переход очень нестабильного промежуточного продукта С* в более стабильный – С m *. Белок Rop обладает высоким сродством к С* и лишь слабо взаимодействует с изолированными РНК I и РНК II in vitro. Предполагают, что Rop проявляет незначительную специфичность в отношении последовательностей нуклеотидов и распознает некоторые общие особенности структуры комплекса РНК I–РНК II, возникающего на ранних этапах их взаимодействия. Таким образом, функции белка Rop, по-видимому, заключаются в преобразовании нестабильного комплекса РНК–РНК в более стабильный, что, в свою очередь, сопровождается подавлением формирования праймера, необходимого для инициации репликации плазмиды ColE1.

Использование антисмысловых РНК в контроле репликации бактериальных плазмид является распространенным приемом. В частности, репликация небольшой, низкокопийной плазмиды R1 контролируется белком RepA, который участвует в инициации репликации плазмиды в качестве позитивного регуляторного фактора. Синтез RepA, в свою очередь, регулируется посттранскрипционно с помощью небольшой антисмысловой РНК CopA, которая связывается с RepA-мРНК в результате многоступенчатой реакции, напоминающей образование гибрида между РНК I и РНК II, рассмотренное выше. Такое взаимодействие подавляет экспрессию гена repA , возможно, вследствие расщепления РНК–РНК-дуплекса РНКазой III. Внутриклеточная концентрация антисмысловой CopA-РНК прямо пропорциональна числу копий плазмиды R1. Аналогичный механизм описан и для регуляции инициации репликации плазмиды pT181 Staphylococcus aurеus.

При получении бактериальных векторов для генной инженерии, многие из которых содержат область начала репликации плазмиды ColE1, с целью повышения числа их копий в бактериальных клетках часто используют ингибиторы биосинтеза белка, в частности хлорамфеникол. После обсуждения механизмов регуляции контроля репликации этой плазмиды становятся понятными принципы, на которых основан данный прием. Действительно, внесение в культуральную среду хлорамфеникола блокирует биосинтез бактериальных белков, в том числе, и белка Rop, который необходим для эффективного подавления инициации репликации плазмиды под действием РНК I. В результате нарушается контроль копийности плазмид в бактериальных клетках, и они начинают непрерывно реплицироваться, используя для этой цели предварительно синтезированные бактериальные белки.

Известно, что две фенотипически различающиеся плазмиды, использующие одинаковый механизм контроля репликации, несовместимы в одной бактериальной клетке. Клетки, содержащие две плазмиды из разных групп совместимости, в процессе размножения быстро образуют две популяции, каждая из которых содержит только один тип плазмид. Это происходит вследствие случайного выбора плазмид для репликации внутри бактериальных клеток и случайного распределения исходного пула плазмид по дочерним клеткам. Эволюционное возникновение механизма контроля репликации бактериальных плазмид с использованием антисмысловых РНК расширило возможности появления плазмид, принадлежащих к разным группам совместимости и сосуществующих в одних и тех же бактериальных клетках. Действительно, несмотря на использование одного и того же механизма, антисмысловые РНК, обладающие разными последовательностями нуклеотидов, не смогут узнавать "чужие," гетерологичные РНК-мишени. Это позволяет таким плазмидам сосуществовать в одной бактериальной клетке и создает условия для их более широкого распространения в природных популяциях микроорганизмов.

Разделы