Drei Fraktionen eukaryotischer DNA, ihre Lokalisierung in Chromosomen und Funktionen. Chromatin: Definition, Struktur und Rolle bei der Zellteilung

In einem Chromatinpräparat macht die DNA normalerweise 30–40 % aus. Diese DNA ist ein doppelsträngiges helikales Molekül. Die DNA eukaryotischer Zellen ist in ihrer Zusammensetzung heterogen und enthält mehrere Klassen von Nukleotidsequenzen: häufig wiederholte Sequenzen (>106-mal), die in der Satelliten-DNA-Fraktion enthalten sind und nicht transkribiert werden; ein Bruchteil mäßig repetitiver Sequenzen (102–105), die Blöcke echter Gene darstellen, sowie kurze Sequenzen, die über das gesamte Genom verstreut sind; ein Bruchteil einzigartiger Sequenzen, der Informationen für die meisten Zellproteine ​​enthält.

Chromatin

Chromatin besteht aus DNA im Komplex mit Protein. In Interphasezellen kann Chromatin das Volumen des Zellkerns gleichmäßig ausfüllen oder in separaten Klumpen (Chromozentren) lokalisiert sein. Oftmals ist es an der Peripherie des Zellkerns (parietales, membrannahes Chromatin) besonders deutlich sichtbar oder bildet im Inneren des Zellkerns Verflechtungen aus ziemlich dicken (ca. 0,3 µm) und langen Strängen, die den Anschein einer intranukleären Kette erwecken.

In der Interphase bildet sich im Bereich des Nukleolarorganisators ein Nukleolus. Euchromatin sind dekondensierte, despiralisierte DNA-Abschnitte, aus denen genetische Informationen über die Aminosäurezusammensetzung des Proteins abgelesen werden (Transkription). Euchromatin – funktionell aktiver Teil Chromosomen.

Heterochromatin sind kondensierte, spiralförmige DNA-Abschnitte. Heterochromatin sind die funktionell inaktiven Teile eines Chromosoms. Heterochromatin wird mit basischen Farbstoffen intensiv gefärbt, während Euchromatin diese Eigenschaft nicht aufweist und als helle, ungefärbte Bereiche zwischen Heterochromatinklumpen erscheint.

Das Chromatin der Interphasekerne ist ein DNA-tragender Körper (Chromosomen), der zu diesem Zeitpunkt seine kompakte Form verliert, sich lockert und dekondensiert. Der Grad einer solchen Chromosomendekondensation kann in den Kernen verschiedener Zellen variieren. Wenn ein Chromosom oder ein Teil davon vollständig dekondensiert ist, werden diese Zonen als diffuses Chromatin bezeichnet. Wenn die Chromosomen unvollständig gelockert sind, sind im Interphasekern Bereiche mit kondensiertem Chromatin (manchmal auch Heterochromatin genannt) sichtbar. Je diffuser das Chromatin des Interphasekerns ist, desto höher sind die Syntheseprozesse darin. Chromatin wird während der mitotischen Zellteilung maximal verdichtet und liegt dann in Form dichter Körper – Chromosomen – vor.

im funktionierenden, teilweise oder vollständig dekondensierten Zustand, wenn die Prozesse der Transkription und Reduplikation unter ihrer Beteiligung am Interphasekern ablaufen;

inaktiv – in einem Zustand metabolischer Ruhe bei maximaler Kondensation, wenn sie die Funktion der Verteilung und Übertragung von genetischem Material auf Tochterzellen erfüllen.

Chemisch gesehen sind Chromatinpräparate komplexe Komplexe von Desoxyribonukleoproteinen, zu denen DNA und spezielle chromosomale Proteine ​​– Histone – gehören.

Chromatinproteine

Dazu gehören Histone und Nicht-Histon-Proteine.

Histone sind stark basische Proteine. Ihre Alkalität hängt mit ihrer Anreicherung an essentiellen Aminosäuren (hauptsächlich Lysin und Arginin) zusammen. Diese Proteine ​​enthalten kein Tryptophan. Das gesamte Histonpräparat kann in 5 Fraktionen aufgeteilt werden:

H1 (vom englischen Histon) – lysinreiches Histon,

H2a – mäßig lysinreiches Histon, H2b – mäßig lysinreiches Histon,

H4 – argininreiches Histon, H3 – argininreiches Histon,

Histone werden auf Polysomen im Zytoplasma synthetisiert; diese Synthese beginnt etwas früher als die DNA-Reduplikation. Synthetisierte Histone wandern vom Zytoplasma zum Zellkern, wo sie sich an DNA-Abschnitte binden.

Nicht-Histon-Proteine ​​sind die am schlechtesten charakterisierte Fraktion des Chromatins.

Yamdryshki

Regionen der Chromosomen, in denen die Synthese ribosomaler Ribonukleinsäuren (rRNA) stattfindet. Sie befinden sich im Inneren des Zellkerns und verfügen über keine eigene Membran, sind aber unter Licht- und Elektronenmikroskopen deutlich sichtbar.

Die Hauptfunktion des Nukleolus ist die Synthese ribosomaler RNA und Ribosomen, an denen im Zytoplasma die Synthese von Polypeptidketten durchgeführt wird. Im Zellgenom gibt es spezielle Regionen, die sogenannten Nukleolarorganisatoren, die ribosomale RNA (rRNA)-Gene enthalten, um die sich Nukleolen bilden. Im Nukleolus wird rRNA durch RNA-Polymerase I, ihre Reifung und den Zusammenbau ribosomaler Untereinheiten synthetisiert. Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, sind im Nukleolus lokalisiert. Einige dieser Proteine ​​​​haben eine spezielle Sequenz – ein Signal für die nukleoläre Lokalisierung. Mithilfe der Elektronenmikroskopie können zwei Hauptkomponenten im Nukleolus identifiziert werden: körnig (entlang der Peripherie) – reifende ribosomale Untereinheiten und fibrillär (in der Mitte) – Ribonukleoproteinstränge von Ribosomenvorläufern.

Die körnige Komponente besteht aus Körnern (Durchmesser 10–20 nm), die aus Ribonukleoproteinpartikeln (ribosomalen Untereinheiten) bestehen. Der fibrilläre Teil besteht aus dichten, dünnen, elektronendichten Filamenten (Durchmesser 5–8 nm), die eine kompakte Masse bilden. Diese Fasern sind um leichtere Kerne konzentriert dichtes Material(fibrilläre Zentren). Es wird angenommen, dass das fibrilläre Material RNA (ribosomale RNA) ist und die fibrillären Zentren aus DNA bestehen und in ihrer Struktur den Chromatinkörnern entsprechen.

Die amorphe Komponente ist blass gefärbt und enthält Bereiche nukleolärer Organisatoren mit spezifischen RNA-bindenden Proteinen und großen DNA-Schleifen, die aktiv an der Transkription ribosomaler RNA beteiligt sind. Die fibrillären und körnigen Komponenten bilden ein Nukleolarfilament (Nukleonem), dessen Dicke beträgt 60-80 nm.

Die Hauptfunktion des Nukleolus ist die Synthese von Ribosomen. Im Zellgenom gibt es spezielle Regionen, die sogenannten Nukleolarorganisatoren, die ribosomale RNA (rRNA)-Gene enthalten, um die sich Nukleolen bilden. Im Nukleolus wird rRNA durch RNA-Polymerase I, ihre Reifung und den Zusammenbau ribosomaler Untereinheiten synthetisiert. Die an diesen Prozessen beteiligten Proteine ​​sind im Nukleolus lokalisiert.

Entfernung von Histon H1 aus transkriptionell aktivem Chromatin 1*2* . IN frühe Erfahrungen J. Bonner (USA) zeigte, dass DNA im Chromatin eine viel schlechtere Matrix ist als freie DNA. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde vorgeschlagen, dass Histone Transkriptionsrepressoren sind.

L. N. Ananyeva und Yu. V. Kozlov Unser Labor wollte herausfinden, ob alle Histone eine hemmende Wirkung haben oder nur einige von ihnen. Zu diesem Zweck wurden Histone aus dem Chromatin von Maus-Ehrlich-Asziteskrebszellen durch Extraktion mit NaCl-Lösungen mit allmählich steigenden Konzentrationen entfernt. Die resultierenden Präparate dienten als Vorlage für die RNA-Synthese. Die Transkription erfolgte in Gegenwart von RNA-Polymerase aus Escherichia coli, E. coli, die im Überschuss entnommen wurde, und einer Mischung aus Nukleosidtriphosphaten. Im Bereich von 0,4–0,6 M NaCl kam es zu einer starken Dekondensation des Materials, die sich im Anschwellen des Kerngels und sogar in der Auflösung von DNP (bei weiterer mechanischer Bearbeitung) äußerte. Es wurde gezeigt, dass dadurch Histon HI selektiv entfernt wird. Gleichzeitig mit der Dekondensation des Chromatins kam es zu einem starken Anstieg seiner Matrixaktivität (Abb. 26). Eine weitere Erhöhung der Salzkonzentration in der Extraktionslösung führte zur Entfernung anderer Histone und zu einer leichten, aber nicht sehr ausgeprägten zusätzlichen Erhöhung der Matrixaktivität.

0 t. Somit zeigt die Hybridisierbarkeit den Prozentsatz sich wiederholender Sequenzen in der synthetisierten RNA (gemäß den Ergebnissen von L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov und dem Autor); b – Hauptparameter der RNA-Synthese auf verschiedenen Matrizen: freie DNA, ursprüngliches Chromatin (DNP 0) und Chromatin, aus dem Histon H1 durch Extraktion mit 0,6 M NaCl (DNP 0,6) entfernt wurde. Die RNA-Synthese wurde unter Verwendung der Escherichia coli-RNA-Polymerase in Gegenwart markierter Nukleosidtriphosphate durchgeführt: [ 14 C]-ATP und entweder [γ- 32 P]-ATP oder [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP war in der gesamten RNA enthalten und [γ- 32 P] – nur am Anfang der Kette (pp x A- oder pp x G). Mit anderen Worten: Der Einschluss von [ 32 P] lieferte Informationen über den Beginn der Synthese und [ 14 C] – über die RNA-Synthese selbst. In einigen Experimenten wurde dem Medium 3-4 Minuten nach Beginn der Inkubation Rifampicin, ein Antibiotikum, zugesetzt, das die Bildung neuer RNA-Ketten verhinderte, aber die bereits begonnene Synthese, d. h. die Verlängerung, nicht beeinträchtigte. 1 – Einbeziehung von [14 C] – UMP, 2 – das gleiche nach Zugabe von Rifampicin; 3 – Einschluss von [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 – das Gleiche nach Zugabe von Rifampicin. Basierend auf diesen Einschlusskurven ist es möglich, die Hauptparameter der RNA-Polymerase-Reaktion zu berechnen (basierend auf den Ergebnissen von Yu. V. Kozlov und dem Autor)“>
Reis. 26. Der Einfluss von Histon H1 auf die Template-Aktivität der DNA im Chromatin. a – die Wirkung der Entfernung von Proteinen aus Chromatin (1) auf dessen Matrixaktivität (2) in Gegenwart der exogenen RNA-Polymerase von Escherichia coli sowie auf die Hybridisierbarkeit der synthetisierten RNA (3). Histone und Nicht-Histon-Proteine ​​wurden mit steigenden Konzentrationen von NaCl-Lösungen extrahiert. Im Bereich von 0,4 M NaCl – 0,6 M NaCl wurde Histon H1 selektiv entfernt. Die synthetisierte RNA wurde mit überschüssiger DNA bei mittleren C0 t-Werten hybridisiert. Somit zeigt die Hybridisierbarkeit den Prozentsatz sich wiederholender Sequenzen in der synthetisierten RNA (gemäß den Ergebnissen von L. N. Ananyeva, Yu. V. Kozlov und dem Autor); b – Hauptparameter der RNA-Synthese auf verschiedenen Matrizen: freie DNA, ursprüngliches Chromatin (DNP 0) und Chromatin, aus dem Histon H1 durch Extraktion mit 0,6 M NaCl (DNP 0,6) entfernt wurde. Die RNA-Synthese wurde unter Verwendung der Escherichia coli-RNA-Polymerase in Gegenwart markierter Nukleosidtriphosphate durchgeführt: [ 14 C]-UTP und entweder [γ- 32 P]-ATP oder [γ- 32 P]-GTP. [ 14 C]-UMP war in der gesamten RNA enthalten und [γ- 32 P] – nur am Anfang der Kette (pp x A- oder pp x G). Mit anderen Worten: Der Einschluss von [ 32 P] lieferte Informationen über den Beginn der Synthese und [ 14 C] – über die RNA-Synthese selbst. In einigen Experimenten wurde dem Medium 3-4 Minuten nach Beginn der Inkubation Rifampicin, ein Antibiotikum, zugesetzt, das die Bildung neuer RNA-Ketten verhinderte, aber die bereits begonnene Synthese, d. h. die Verlängerung, nicht beeinträchtigte. 1 – Einbeziehung von [14 C] – UMP, 2 – das gleiche nach Zugabe von Rifampicin; 3 – Einschluss von [γ- 32 P]-ATP + GTP; 4 – das Gleiche nach Zugabe von Rifampicin. Basierend auf diesen Einschlusskurven können die Hauptparameter der RNA-Polymerase-Reaktion berechnet werden (basierend auf den Ergebnissen von Yu. V. Kozlov und dem Autor).

Die Eigenschaften des Synthetisierten in vitro RNA durch Hybridisierung mit Gesamt-Maus-DNA. In diesem Fall wurde ein Teil der RNA nachgewiesen, die auf sich wiederholenden DNA-Sequenzen synthetisiert wurde. Es stellte sich heraus, dass im Chromatin die Transkription wiederholter DNA-Sequenzen begrenzt ist. Nach der Extraktion von Chromatin mit 0,6 M NaCl und der Entfernung von Histon H1 waren die Hybridisierungseigenschaften der auf der Matrix dieses Chromatins und auf der Matrix freier DNA synthetisierten RNA jedoch nicht mehr zu unterscheiden. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Histone H2a, H2b, H3 und H4 (damals anders genannt – mäßig lysinreiche und argininreiche Histone) nicht an der Unterdrückung der Transkription beteiligt sind, sondern eine rein strukturelle Rolle bei der Chromatinorganisation spielen, während Histon H1 (im alten Terminologie Histon, reich an Lysin) ist ein Inhibitor der RNA-Synthese. Gleichzeitig ist es auch ein Faktor, der die Chromatinkondensation verursacht (siehe oben).

Später untersuchte Yu. V. Kozlov den Mechanismus der Transkriptionshemmung durch Histon H1, wiederum an einem zellfreien System mit aus E. coli isolierter RNA-Polymerase. Die Wirkung von Histon H1 auf die Prozesse der Initiierung und Verlängerung wurde untersucht (siehe Abb. 26, Tabelle 4). Es stellte sich heraus, dass es die Anzahl der auf der nativen Chromatinmatrix initiierten RNA-Ketten um ein Vielfaches reduziert. Die Verlängerung wird besonders stark gehemmt: Die RNA-Polymerase misst nicht mehr als 100-150 bp. DNA und dann stoppt. Währenddessen liest die RNA-Polymerase auf Chromatin, aus dem Histon H1 entfernt wurde, mehrere tausend Nukleotidpaare gleichzeitig, und die Länge der Ketten unterscheidet sich nicht von der Länge der auf der freien DNA-Matrize synthetisierten Ketten. Zwar laufen die Prozesse zur Initiierung der RNA-Synthese auf freier DNA im Vergleich zu Chromatin, aus dem Histon H1 entfernt wurde, effizienter ab. Daraus wurde geschlossen, dass Histon H1 durch die Kondensierung von Chromatin Hindernisse im Weg der RNA-Polymerase schafft und dadurch die RNA-Synthese stoppt.

* (DNPM ist durch Harnstoffbehandlung isoliertes DNP, das vollständig solubilisiert ist, aber Histon H1 behält.)

Angesichts moderner Daten zur Magnetstruktur der 300 A-DNP-Fibrille, die von der Anwesenheit von Histon H1 abhängt, lässt sich dieses Ergebnis leicht erklären. Tatsächlich kann die RNA-Polymerase offensichtlich nicht mehr als 100 bp im Solenoid lesen. aufgrund rein topologischer Einschränkungen.

Nach unserer Hypothese sollte bei der Aktivierung des Gens Histon H1 entfernt werden. Eine Überprüfung war zu diesem Zeitpunkt jedoch nicht möglich. Erst vor relativ kurzer Zeit gab es Hinweise auf den Verlust von Histon H1 aus dem Chromatin während der Genaktivierung. Wenn aktiv transkribierte Regionen des Chromatins, beispielsweise Mini-Nukleoli, aus einer Reihe von Organismen isoliert wurden, wurde Histon H1 in ihnen nicht nachgewiesen. Es kommt auch nicht in Hefe vor, wo alle Gene potenziell aktiv sind.

Im Labor wurden überzeugende Ergebnisse erzielt A. D. Mirzabekova V. L. Karpov und O. V. Preobrazhenskaya. Sie entwickelten eine Methode namens „Histon-Schatten-Hybridisierung“. Dazu wurde DNA mit Histonen unter Verwendung von Dimethylsulfat unter Bedingungen vernetzt, bei denen durchschnittlich ein Histonmolekül pro DNA-Segment von etwa 200–300 bp Länge vernetzt wird. Anschließend wurde die DNA fragmentiert und eine zweidimensionale Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Nach dem Lauf in die erste Richtung wurden die an der DNA befestigten Histone durch Proteinase zerstört und die bereits freie DNA in die zweite Richtung beschleunigt. Da während der ersten Runde der Elektrophorese verschiedene Histone die Bewegung von DNA-Fragmenten auf unterschiedliche Weise verlangsamten, zeigten sich nach der zweiten Runde mehrere Diagonalen (Abb. 27). Normalerweise sind drei deutlich sichtbar: einer entspricht der ursprünglich freien DNA, der andere den ursprünglichen DNA-Komplexen mit Kernhistonen und der dritte (unten) dem ursprünglichen DNA-Komplex mit Histon H1. Die resultierende DNA wird auf einen Filter übertragen und mit einer bestimmten Probe hybridisiert. Wenn eine inaktive Region des Genoms zur Hybridisierung verwendet wurde, beispielsweise der Spacer des ribosomalen Gens von Drosophila, dann war die Markierung mit allen Diagonalen verknüpft. Wenn jedoch das Hitzeschock-Gen als Probe verwendet wurde, das in den Zellen transkribiert wurde, aus denen Chromatin isoliert wurde, war die Hybridisierung mit der Diagonale, die DNA-Komplexen mit Histon H1 entspricht, stark abgeschwächt oder fehlte vollständig. Mit anderen Worten: In den Kernen hatte die DNA des transkribierten Gens vor der Anheftung keinen Kontakt mit Histon H1.

Reis. 27. Verlust von Histon H1 und Kernhistonen bei Transkriptionsaktivierung. Experimente wurden an D. melanogaster-Kulturzellen (a, b) unter Kultivierungsbedingungen bei 25° (a) und Hitzeschock (b) durchgeführt. Im Fall a gibt es keine Expression von Hitzeschockgenen; im Fall b ist es sehr aktiv. Darüber hinaus wurden Experimente an dechorionisierten Embryonen (c) durchgeführt, bei denen die Expression von Hitzeschockgenen auf einem durchschnittlichen Niveau liegt. Nach der Bildung von DNA-Protein-Komplexen, der Isolierung von DNA-Fragmenten, ihrer zweidimensionalen Trennung (in vertikaler Richtung nach Entfernung des Proteins) und der Übertragung auf einen Filter wurden dieselben Filter mit verschiedenen Proben hybridisiert: mit der regulatorischen Region von das p70-Hitzeschock-Gen (HS-5"); mit der kodierenden Region desselben Gens (TS-Code); mit einer transkriptionell inaktiven Insertion in das rDNA-Gen (inaktiv), drei Diagonalen sind sichtbar; 1 - freie DNA, 2 - DNA-Komplexe mit Octamer-Histonen; Mit Histon H1 ist die Schwächung oder das Verschwinden von DNA-Histon-Komplexen bei der Aktivierung von Chromatin sichtbar (gemäß den Ergebnissen von A. D. Mirzabekov et al.).

Obwohl alle derzeit verfügbaren Daten einzeln betrachtet andere Interpretationen zulassen, liefern sie zusammengenommen starke Beweise für die Entfernung von Histon H1 aus aktivem Chromatin. Der Mechanismus dieses Prozesses ist jedoch noch völlig unklar.

Schicksal von Nukleosomen während der Chromatinaktivierung 2* [154-157]. Weniger klar ist die Frage nach dem Schicksal der Histone H2a, H2b, H3 und H4, die den Kern des Nukleosoms bilden. In den obigen Experimenten Yu. V. Kozlova Ihre Anwesenheit hatte praktisch keinen Einfluss auf die Transkription von DNA durch RNA-Polymerase E coli. Bei der Untersuchung der Produkte der eukaryotischen Chromatinhydrolyse stellten viele Autoren fest, dass Nukleosomen DNA aktiver Gene enthalten, d. h. letztere sind ebenfalls in Nukleosomen organisiert. Daten aus großem experimentellem Material A. D. Mirzabekova et al. zeigen, dass Nukleosomen, die aktiv transkribierte DNA enthalten, grundsätzlich auf die gleiche Weise aufgebaut sind wie Nukleosomen, die inaktive DNA enthalten, obwohl einige DNA-Histon-Kontakte in ihnen verändert sind.

Es wurden auch Experimente zur Hybridisierung mit Histonschatten durchgeführt, die im vorherigen Abschnitt besprochen wurden (siehe Abb. 27). Präparate mit Diagonalen wurden aus Drosophila-Zellen hergestellt, in denen Hitzeschock-Gene entweder überhaupt nicht funktionierten, das heißt, sie waren ausgeschaltet, oder sie arbeiteten auf einem niedrigen Niveau, oder sie wurden schließlich durch Hitzeschock zur aktiven Transkription angeregt. In allen Fällen handelte es sich bei der Kontrollprobe um die DNA des ribosomalen Genspacers, die in allen drei Diagonalen hybridisierte, einschließlich der Diagonale, die aus DNA-Komplexen mit Kernhistonen stammte.

Auch das Hitzeschock-Gen hybridisierte normal mit dieser Diagonale aus Zellen, in denen es nicht transkribiert wurde. Bei Material aus Zellen mit mäßiger Transkription des Hitzeschock-Gens war die Hybridisierung der zweiten Diagonale jedoch deutlich reduziert. Wenn schließlich die Diagonalen aus Zellen mit sehr aktiver Hitzeschock-mRNA-Synthese gewonnen wurden, war die zweite Diagonale während der Hybridisierung überhaupt nicht sichtbar (ebenso wie die dritte), und nur die Diagonale wurde sichtbar, die der nicht vernetzten DNA entsprach Die allgemeine Schlussfolgerung aus Studien mit der Methode der DNA-Protein-Vernetzung war, dass die RNA-Polymerase, die sich entlang der DNA-Kette bewegt, Nukleosomen reversibel mit DNA kollidiert und praktisch nackte DNA transkribiert. Wenn die Transkription niedrig ist und nur wenige RNA-Polymerasen entlang der DNA kriechen, haben die Nukleosomen Zeit, sich in dem Bereich, den die RNA-Polymerase bereits passiert hat, erneut zu bilden. Wenn die Transkription aktiv ist, hat die nukleosomale Struktur der DNA keine Zeit, wiederhergestellt zu werden, und die DNA ist im Allgemeinen frei von Histonen. Gleichzeitig wird postuliert, dass sich die Organisation der Nukleosomen im aktiven Chromatin praktisch nicht von der im inaktiven Chromatin unterscheidet. Kürzlich haben A.D. Mirzabekov et al. reproduzierte Experimente zur Bindung von Histonen an DNA mit einer anderen Methode, indem er isolierte Kerne mit Platinpräparaten behandelte. Diese Methode ist milder als Dimethylsulfat. Grundsätzlich wurden die gleichen Ergebnisse erzielt.

Neben dieser Datenlage gibt es Studien, in denen die Autoren zu etwas anderen Schlussfolgerungen kommen. V. Garrard und A. Worsel(USA), die den Zustand aktiver Gene im Chromatin mithilfe von Nukleasehydrolyse und Elektronenmikroskopie untersuchten, kamen zu dem Schluss, dass Nukleosomen im aktiven Chromatin verbleiben, aber strukturelle Veränderungen erfahren, wie z. B. eine Drehung und Umwandlung in Halbnukleosomen. Infolgedessen beträgt die Periodizität in Elektropherogrammen von Hydrolysaten mit Mikrokokken-Nuklease ~200 bp. durch eine Periodizität von ~100 bp ersetzt. Bei der Elektronenmikroskopie verdoppelt sich die Anzahl der Kügelchen und ihre Größe nimmt ab. Es wird angenommen, dass die RNA-Polymerase solche ungefalteten Nukleosomen passieren kann.

Diese Möglichkeit wird auch durch die gewonnenen Daten gestützt T. Koller(Schweiz). Er entwickelte ursprüngliche Methode Untersuchung von Nukleosomen. Die Zellen werden mit Psoralen behandelt, einer Substanz, die an DNA bindet und dann zwei DNA-Stränge mit UV-Licht miteinander vernetzt. Wenn DNA jedoch Teil von Nukleosomen ist, findet ihre Reaktion mit Psoralen nicht statt. Wenn daher aus behandelten Zellen isolierte DNA in Gegenwart von Formaldehyd denaturiert wird (dies verhindert die Renaturierung der DNA), dann bilden sich bei der Elektronenmikroskopie alternierende Blasen (zwei Stränge denaturierter DNA), die Nukleosomen entsprechen, die durch Einzelstränge miteinander verbunden sind (Kreuz). -verknüpfte, nicht denaturierbare) sind auf der DNA sichtbar und entsprechen internukleosomalen Linkern. Zunächst wurden aktiv transkribierte ribosomale RNA-Gene untersucht, die Teil extrachromosomaler Strukturen sind und daher leicht mithilfe der Elektronenmikroskopie analysiert werden können. In ihnen sind Vesikel, die Nukleosomen entsprechen, nicht sichtbar, d. h. Histone sind aller Wahrscheinlichkeit nach vollständig aus den transkribierten Regionen entfernt. Interessanterweise sind in den nicht transkribierten Regionen, den Spacern, DNA-Blasen (Nukleosomen) deutlich sichtbar.

Bei SV40-Minichromosomen, die wie die ribosomalen RNA-Gene eher von RNA-Polymerase II als von RNA-Polymerase I transkribiert werden, wurden jedoch unterschiedliche Ergebnisse erzielt (Abb. 28). Transkriptionell aktive Mini-Chromosomen werden durch das Vorhandensein wachsender RNA-Ketten (normalerweise eine oder zwei) auf ihnen identifiziert. Solche Mini-Chromosomen machen 1-2 % aller aus der Zelle isolierten Mini-Chromosomen aus. Sie enthalten jedoch genauso viele Vesikel wie inaktive Minichromosomen und ihre Größe ist in beiden Fällen gleich. Das Interessanteste ist, dass die RNA-Ketten sowohl von den Linkern als auch direkt von den Vesikeln ausgehen, d. h. die RNA-Polymerase transkribiert offenbar Nukleosomen. Diese Daten unterstützen die Entfaltung von Nukleosomen und deren Transkription durch RNA-Polymerase.

Alle oben genannten Ergebnisse sind nicht direkt und daher endgültige Entscheidung Die Frage nach dem Schicksal der Nukleosomen während der Transkription sollte durch zukünftige Experimente beantwortet werden.

Histonmodifikation und Histonvarianten: Assoziation mit aktivem Chromatin. Bereits Anfang der 60er Jahre zeigte Allfrey (USA), dass Histone verschiedene Modifikationen erfahren können. Somit wird Histon HI an den ε-Aminogruppen von Lysinen phosphoryliert. Die Histone H3 und H4 werden an denselben Gruppen acetyliert. Es gibt eine Reihe weiterer Modifikationen (Methylierung, ADP-Ribosylierung, Ubiquitinierung usw.).

Es wurde sofort angenommen, dass enzymatische Modifikationen von Histonen die Struktur des Chromatins und seine Aktivität beeinflussen könnten. Tatsächlich wird bei der Phosphorylierung von Lysin eine positive Ladung in einem Histon durch eine negative ersetzt, eine positive Ladung geht verloren usw. Dank solcher Ladungsänderungen können modifizierte Histone bei der Durchführung getrennt werden Gelelektrophorese in einem Acetatpuffer mit Harnstoff. Somit ergibt Histon H4 in der hochauflösenden Elektrophorese nicht eine, sondern vier Banden, die Molekülen entsprechen, die nicht acetyliert sind und an einem, zwei und drei Lysinresten acetyliert sind. In verschiedenen Geweben ändert sich das Verhältnis zwischen den Fraktionen. Die Histone H3, H2a, H2b und H1 werden in mehrere Fraktionen (unterschiedliche Acetylierungs- und Phosphorylierungsgrade) unterteilt.

Leider gibt es immer noch keine guten Methoden zur Trennung von transkriptionell aktivem und inaktivem Chromatin und daher ist es schwierig, veränderte Histonformen dem einen oder anderen Chromatinzustand zuzuordnen. Die interessantesten Daten in dieser Richtung wurden von demselben erhalten W. Alfrey(USA). Bei der Hydrolyse von aktivem Chromatin isolierte er ungewöhnliche Partikel, die im Saccharosegradienten langsamer sedimentierten als gewöhnliche Nukleosomen und nach Meinung des Autors entfalteten Nukleosomen entsprachen. Diese Partikel, A-Partikel genannt, enthielten alle Kernhistone. Im Gegensatz zu normalen Nukleosomen waren die SH-Gruppen von Histon H3 in A-Partikeln für eine Reihe chemischer Reagenzien zugänglich, und aus diesem Grund konnten A-Partikel durch Fraktionierung auf Chlormercuribenzoat-Säulen (einem SH-Gruppen-bindenden Reagenz) von Nukleosomen getrennt werden. A-Partikel enthalten einen erhöhten Gehalt an acetylierten Formen von Histonen. Der Autor schlägt vor, dass die Histonacetylierung bei der Chromatinaktivierung zur Entfaltung nukleosomaler Partikel führt, was wiederum die Verfügbarkeit von SH-Gruppen von Histon H3 erhöht.

Einige Histone werden von mehr als einem Gentyp kodiert. Daher gibt es mehrere Varianten dieser Histone, die sich in ihrer Aminosäuresequenz geringfügig unterscheiden. Manchmal kommt es im Verlauf der Ontogenese zu einem natürlichen Ersatz einer Histon-Unterklasse durch eine andere. Es bleibt jedoch unklar, ob dies eine regulatorische Bedeutung hat. Das Problem kann natürlich auch gelöst werden, wenn geeignete Methoden zur Isolierung transkriptionell aktiven Chromatins entwickelt werden.

Eine Sonderstellung nimmt das Histon H1 ein. Dafür gibt es Optionen, die sich in ihrer strukturellen Organisation stark unterscheiden. Diese Option ist beispielsweise Histon H5, das einen erheblichen Teil von Histon H1 in den Kernen von Vogelerythrozyten ersetzt. Aller Wahrscheinlichkeit nach ist diese Substitution ein wichtiger Faktor für die vollständige Abschaltung der Transkription in den Erythrozytenkernen. IN gewöhnliche Zellen Es gibt eine Variante von Histon H1 – Histon H1 0. Sein Inhalt macht einen kleinen Teil des gesamten Histons H1 aus. Es gibt eine Reihe widersprüchlicher Daten, dass H1 0 mit aktiven Genen oder umgekehrt mit stabil ausgeschalteten Genen assoziiert ist. Die Frage bleibt offen.

HMG-Proteine ​​könnten an der Organisation von aktivem Chromatin beteiligt sein 1* . Neben Histonen enthält Chromatin viele Nicht-Histon-Proteine, deren Funktion unbekannt ist. Darunter sollten sich natürlich Strukturproteine, Enzyme, die die Prozesse der Replikation, Transkription usw. sicherstellen, und regulatorische Proteine ​​befinden. E. Jones(Großbritannien) versuchten, Proteinbestandteile zu isolieren, die in ausreichend großen Mengen vorhanden waren, um ihre Analyse und Identifizierung zu ermöglichen. Er hat es wirklich geschafft, sich zu isolieren neue Klasse Kernproteine, die er „eine Gruppe von Proteinen mit hoher Mobilität“ nannte ( Gruppe mit hoher Mobilität) oder HMG-Proteine. Der Name beruht auf der hohen Mobilität dieser Proteine ​​während der Gelelektrophorese. Die HMG-Proteinfraktion zerfällt in mehrere Einzelkomponenten. Unter ihnen sind HMG-1, HMG-2, HMG-14 und HMG-17 die repräsentativsten und am besten charakterisierten.

HMG-Proteine ​​​​haben ein niedriges Molekulargewicht. Sie sind sowohl mit basischen als auch mit Dicarbonsäuren angereichert. Der Gehalt an HMG-Proteinen beträgt etwa 7 % des Gehalts an Histonen. In Kernen von verschiedene Typen Zellen kann es variieren. In diesem Zusammenhang interessieren uns vor allem die Proteine ​​HMG-14 und HMG-17, für die Hinweise auf eine mögliche Rolle bei der Transkriptionsaktivierung vorliegen. H. Weintraub(USA) zeigten, dass die Kernextraktion mit 0,35 M NaCl, die HMG-Proteine ​​extrahiert, einige Eigenschaften des aktiven Chromatins verändert, die wiederhergestellt werden, wenn dem Chromatin HMG-14 und HMG-17 hinzugefügt werden. G. Dixon(Kanada) entdeckte diese Proteine ​​in der Zusammensetzung von Nukleosomen, die in den frühen Stadien der Hydrolyse durch Nuklease aus Chromatin freigesetzt wurden und die seinen Daten zufolge in der DNA traktionsaktiver Gene angereichert waren.

endet [ 32 P] und hybridisiert dann mit hnRNA aus L-Zellen. Hybride wurden durch Gelfiltration nachgewiesen. 1 - CH-2-DNA; 2 – CH-3-DNA; 3 - Gesamt-DNA der Zelle (gemäß den Ergebnissen von V.V. Bakaev et al.)">
Reis. 29. Mögliche Verbindung von HMG-Proteinen (14 und 17) mit aktivem Chromatin. a – Nachweis von Subnukleosomen in Chromatinhydrolysaten mittels Mikrokokken-Nuklease. In verschiedenen Hydrolysestadien treten bestimmte Fraktionen von Subnukleosomen auf. Die Elektrophorese wurde in Polyacrylamidgel unter nicht denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Färbung mit Ethidiumbromid, Fluorographie in der rechten Spalte; b – Verwendung der zweidimensionalen Elektrophorese zur Bestimmung der Proteinzusammensetzung von CH2- und CH3-Subnukleosomen. Mit [14 C]-Protein markiertes Chromatin wurde mit Mikrokokken-Nuklease hydrolysiert und durch zweidimensionale Elektrophorese (1. Richtung – nicht dissoziierendes Medium, 2. Richtung – Natriumdodecylsulfatlösung) aufgetrennt. Anschließend wurde eine Autoradiographie zur Identifizierung von Proteinen durchgeführt. Die Buchstaben weisen auf HMG-Proteine ​​hin, die zum Zeitpunkt des Experiments noch nicht mit den bekannten identifiziert werden konnten. Jetzt wissen wir, dass A HMG-1 ist, B HMG-2 ist, E HMG-14 ist, G HMG-17 ist, die HMG-Proteine ​​F und H sind nicht eindeutig identifiziert, wahrscheinlich entspricht H auch HMG-17. Es ist ersichtlich, dass HMG-Proteine ​​Teil der Mononukleosomen (MH-2 und MH-3) und der Subnukleosomen CH-2 (HMG-17) und CH-3 (HMG-14) sind; c – Demonstration der DNA-Anreicherung von CH-2- und CH-3-transkribierten Sequenzen. Aus den CH-2- und CH-3-Banden von L-Zellen isolierte DNA wurde an den 5"-Enden markiert [32 P] und dann mit hnRNA aus L-Zellen hybridisiert. Hybride wurden durch Gelfiltration nachgewiesen. 1 - CH-2-DNA; 2 - CH-3-DNA; 3 - Gesamt-DNA der Zelle (gemäß den Ergebnissen von V.V. Bakaev et al.)

V. V. Bakajew In unserem Labor kamen wir mithilfe eines anderen experimentellen Ansatzes zu dem Schluss, welche Rolle HMG-Proteine ​​bei der Transkription spielen. Bei der elektrophoretischen Analyse von Chromatinhydrolysaten entdeckte er neben Nukleosomen und Oligonukleosomen auch kleinere Bestandteile mit größerer Mobilität. Sie wurden Subnukleosomen genannt und waren offensichtlich Produkte des weiteren Abbaus des Nukleosoms (Abb. 29, Tabelle 5). Das Subnukleosom CH-7 entsprach einem Nukleosom, das jeweils ein Molekül H2a und H2b verloren hatte und um 40 bp verkürzte DNA enthielt. CH-6 entsprach einem DNA-Komplex mit einer Länge von 30–40 bp. mit Histon H1, das bei seiner Umwandlung in MH-1 von MH-2 abgespalten wird. CH-4 enthielt ein DNA-Segment und ein Histonepaar H2a und H2b (das Produkt der Reaktion MH-1→CH-7→CH-4). Zwei Subnukleosomen, CH-3 und CH-2, bestanden aus kurzer DNA und HMG-Proteinen (HMG-14 und HMG-17). Es könnte angenommen werden, dass es sich um Linkerregionen handelt, die mit den Proteinen HMG-14 und HMG-17 assoziiert sind und beim Verdau der entsprechenden Nukleosomen in Lösung gehen. CH-2 und CH-3 wurden gesammelt, daraus DNA isoliert, endmarkiert und ihre Hybridisierung mit Kern-RNA untersucht. Es stellte sich heraus, dass DNA aus CH-2 und CH-3 viel effizienter mit Kern-RNA hybridisiert als die gesamte Zell-DNA, die auf die gleiche Größe fragmentiert ist.

Daraus wurde geschlossen, dass die mit den HMG-14- und HMG-17-Proteinen assoziierte DNA wahrscheinlich aus transkriptionell aktivem Chromatin stammt.

Alle diese unabhängig voneinander gewonnenen Daten legen nahe, dass HMG-14 und HMG-17 irgendwie mit der Genaktivierung verbunden sind. Der Aktivierungsmechanismus war jedoch völlig unklar. HMG-14 und HMG-17 könnten nicht die primären Faktoren sein, die das Gen aktivieren, da ihnen die Spezifität fehlt. Man könnte meinen, dass sie an der Aufrechterhaltung der „offenen Konformation“ des aktiven Chromatins beteiligt sind.

In den folgenden Jahren kam es zu Skepsis hinsichtlich der Rolle von HMG-14 und HMG-17 bei der Chromatinaktivierung. Insbesondere in letzter Zeit A. D. Mirzabekov et al. Mithilfe der Methode der Hybridisierung mit Proteingeweben erhielten wir Daten zur Abreicherung des aktiven Chromatins von HMG-14 und HMG-17. Da jedoch alle oben genannten Daten indirekt sind, bleibt die Frage nach der Rolle von HMG-Proteinen im Allgemeinen offen und bedarf weiterer Untersuchungen.

Topoisomerase I und fest an die DNA gebundene Proteine ​​sind Teil des transkriptionell aktiven Chromatins 1* . S. Elgin (USA), gefolgt von einer Reihe anderer Autoren, zeigte, dass transkriptionell aktives Chromatin Topoisomerase I enthält, ein Enzym, das superspiralisierte DNA entspannt. Dies wurde erstmals an zytologischen Präparaten von Drosophila-Polytänenchromosomen unter Verwendung fluoreszierender Antikörper gegen Topoisomerase I nachgewiesen. Dieses Enzym führt einen Einzelstrangbruch in die DNA ein und bindet kovalent an das resultierende 5-Zoll-Ende der DNA. Dadurch kann sich die DNA frei drehen Dann wird das Fragment abgespalten und die Phosphodiesterbindung in der DNA wiederhergestellt. Topoisomerase I, kurz Topo I, hat ein heterogenes Molekulargewicht. 135 kDa, und am reichsten vertreten - 80 kDa. Bei der Spaltung durch Proteinasen entstehen kürzere Polypeptide, die dennoch ihre enzymatische Aktivität behalten.

Das Antibiotikum Captothecin ist ein Topo-I-Inhibitor, und wenn Zellen damit behandelt werden, bildet das Enzym kovalente Vernetzungen mit der DNA an der Stelle, an der es sich zum Zeitpunkt des Kontakts mit dem Antibiotikum befand. Der Ort solcher Vernetzungen kann leicht durch Kartierung mithilfe eines Hybridisierungs-Tags bestimmt werden. Auf diese Weise wurde entdeckt, dass Topo I ausschließlich in transkribierten Regionen des Genoms vorhanden ist, d. h. höchstwahrscheinlich mit der RNA-Polymerase II zusammenarbeitet und lokale DNA-Verdrehungen entfernt, die während der Transkription auftreten.

Eine weitere Proteinkomponente, die in den transkribierten Regionen des Genoms nachgewiesen wird, ist ein Satz fest an DNA gebundener Proteine ​​(DBP), die der transkribierten DNA der Zelle entsprechen (siehe Abschnitt 3.4).

S. V. Razin und V. V. Chernokhvostov Es wurde versucht, Komplexe von DNA mit PBP detailliert zu charakterisieren. Mit PBP assoziierte DNA-Fragmente mit einer Länge von 1–2 kb wurden gereinigt und einer Gleichgewichts-Ultrazentrifugation in einem CsCl-Dichtegradienten unterzogen. Es stellte sich heraus, dass ihre Auftriebsdichte gleich war 1,7 g/cm3, d. h. sie entsprach der Auftriebsdichte freier DNA, die kein Protein enthielt. In Experimenten zur Erklärung dieses Paradoxons wurde festgestellt, dass die Behandlung mit DRNase zu einer Verringerung der Auftriebsdichte der Komplexe führt 1,62-1,65 g/cm3. Ungefähre Berechnungen basierend auf der Proteindichte ( ~ 1,3 g/cm3) und RNA ( ~ 1,9 g/cm3), (Zeigen Sie, dass es für jedes DNA-Molekül etwa gibt 150 kDa Protein und etwa 200 Nukleotide RNA. Die Natur dieser RNA ist unklar, es wurden jedoch Beweise für ihre Homogenität und einzigartige Nukleotidsequenz erhalten.

Daher bleibt vieles über DNA-PBP-Komplexe rätselhaft, aber aller Wahrscheinlichkeit nach spielen sie eine bedeutende Rolle bei der Organisation der Transkriptionsmaschinerie. Ihre Forschung ist derzeit im Gange.

DNA-Demethylierung in transkribierten Genen 2*. Einer noch wichtiges Merkmal Aktives Chromatin ist die Demethylierung bestimmter DNA-Abschnitte. In inaktiven Genen sind die meisten Cytidylreste innerhalb der CG-Sequenzen methyliert. Erste B. V. Vanyushin im Labor A. N. Belozersky Es wurde gezeigt, dass sich die DNA in verschiedenen Geweben desselben Tieres im Grad der C-Methylierung unterscheidet. Auf dieser Grundlage wurde vermutet, dass die Methylierung eine regulatorische Rolle bei der Differenzierung spielen könnte. Später zeigten viele Autoren, dass einige Regionen in der transkribierten DNA untermethyliert sind. Die am weitesten verbreitete Analysemethode ist der Vergleich von Restriktionskarten, die mit Restriktionsenzymen erhalten wurden, die dieselbe Sequenz erkennen, wie z. B. CGCG oder CCGG unterschiedliche Empfindlichkeit zur Methylierung. Eines der Restriktionsenzyme spaltet sowohl methylierte als auch unmethylierte Sequenzen, das andere spaltet nur unmethylierte. Typischerweise sind unmethylierte Sequenzen in der regulatorischen Region des Gens lokalisiert. Die Region des Gens selbst, sein kodierender Teil und seine Introns sind sowohl in arbeitenden als auch in stillen Genen gleichermaßen methyliert.

Wenn methylierte DNA in Zellen eingebracht wird, ist ihre Expression in der Zelle im Vergleich zu unmethylierter DNA deutlich reduziert. Es liegen Daten vor, nach denen bei der DNA-Replikation der Zustand der DNA-Methylierung reproduziert wird: Ist eine der Ketten methyliert, wird auch die neu gebildete Kette an derselben Stelle methyliert.

Früher schien es, dass die Methylierung-Demethylierung von Cytidin in den CG-Sequenzen der regulatorischen Region der Hauptmechanismus der Gen-Inaktivierung-Aktivierung ist. Allerdings in In letzter Zeit Es liegen zahlreiche Daten vor, die dieser Hypothese widersprechen. Somit wird vollständig CG-methylierte SV40-DNA aktiv exprimiert. Gleichzeitig wird Methylcytosin in der DNA von Drosophila überhaupt nicht nachgewiesen. Es ist möglich, dass die Demethylierung von C eine Folge der Genaktivierung ist und nur den Zustand der Transkriptionsaktivität aufrechterhält. Hier, wie auch in anderen Bereichen der Genaktivierungsforschung, sind neue Experimente erforderlich.

Zur Isolierung von Chromatin nutzt man dessen Fähigkeit, sich bei der Extraktion mit wässrigen Lösungen geringer Ionenstärke aufzulösen.

Histonproteine ​​machen 40 bis 80 % aller Proteine ​​aus, aus denen isoliertes Chromatin besteht (der Rest sind Membrankomponenten, RNA, Kohlenhydrate, Lipide, Glykoproteine).

Strukturell ist Chromatin (Nukleohiston) ein filamentöses komplexes Molekül des Desoxyribonukleoproteins ( DNP), die aus mit Histonen assoziierter DNA bestehen.

Dicke der DNP-Fibrillen: 10-30 nm

Molekulargewicht von DNA-Chromatin: 7-9*10^6

DNA-Konzentration im Interphasekern: bis zu 100 mg/ml.

Im Durchschnitt enthält der Interphasenkern etwa 2 m DNA, die in einem kugelförmigen Kern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 10 μm lokalisiert ist. Das bedeutet, dass eine so große DNA-Masse mit einem Packungsverhältnis von 1*10^3 – 1*10^4 gepackt werden muss

Eukaryontische Zellen enthalten nur 5-7 Arten von Histonmolekülen.

Die Wechselwirkung von Histonen mit DNA erfolgt aufgrund von Salz- oder Ionenbindungen und ist hinsichtlich der Zusammensetzung und Sequenz der Nukleotide in der DNA unspezifisch.

Grundlegende Eigenschaften von Histonen:

1) Hierbei handelt es sich um alkalische Proteine, deren Eigenschaften durch den relativ hohen Gehalt an basischen Aminosäuren wie Lysin und Arginin bestimmt werden (aufgrund des Vorhandenseins positiver Ladungen an den Aminogruppen von Lysin und Arginin).

2) Relativ kleines Molekulargewicht.

Histone H3 und H4 als argininreich eingestuft H2A und H2B werden als mäßig an Lysin angereicherte Proteine ​​klassifiziert. Histone H1 angereichert mit Lysin.

Im Histon H1 ist es am variabelsten N-Terminus, das mit anderen Histonen kommuniziert, ein C-Terminus, reich an Lysin, interagiert mit DNA.

Histone werden im Zytoplasma synthetisiert, zum Zellkern transportiert und binden während der Replikation in der S-Periode an die DNA, d. h. Histon- und DNA-Synthese sind synchronisiert.

Ebenen der DNA-Verdichtung:

1) Nukleosomal

2) Nukleomer

3) Chromomer

4) Lahm

5) Chromatid

1) Histonfaltung.

Histontypen: H1, H2A, H2B, H3, H4.

Histone sind positiv geladen und interagieren gut mit negativ geladener DNA.

Histon H1 wird in einer Lösung von 0,6 M NaCl abgetrennt. Alle Histone werden in einer 2M-Lösung getrennt.

Der N-Terminus des Histons interagiert mit anderen Histonen und ist variabel. Der C-Terminus ist konserviert und interagiert mit der DNA.

Die am stärksten konservierten Histone sind H3 und H4.

Nukleosom– ein diskretes Chromatinpartikel. Das gesamte haploide menschliche Genom enthält 1,5 * 10^7 Nukleosomen.

Der Faltungskoeffizient bei Histonen beträgt K=7, die DNA wird um das Siebenfache verkürzt.

Eine Wicklung= 146 Basenpaare. Zwischen Nukleosomen ( Linker) 54 Basenpaare. Zeitraum gleich 200 Nukleotiden.

Es wird angenommen, dass die Ablage von fast zwei DNA-Windungen entlang der Peripherie des Nukleosomenkerns auf die Wechselwirkung positiv geladener Aminosäurereste auf der Oberfläche des Histonoktameters mit DNA-Phosphaten zurückzuführen ist.

Es stellte sich heraus, dass die Histone H3 und H4 eine Schlüsselrolle beim Aufbau von Nukleosomen spielen (siehe Bild im Notizbuch!!!)

Zum Zeitpunkt der DNA-Synthese gibt es bereits einen Pool synthetisierter Histone aller Klassen, die bereit sind, Teil von Nukleosomen zu werden. Histon-Gene, die zur Fraktion der mäßig repetitiven DNA-Sequenzen gehören, werden als Mehrfachkopien für jedes Histon dargestellt. Sie werden zusammen mit dem Beginn der DNA-Synthese aktiviert, sodass mit fortschreitender Replikationsgabel neue DNA-Abschnitte sofort mit neu synthetisierten Histonen interagieren können.

Neu synthetisierte Histone und alte Histone innerhalb der vorhergehenden Nukleosomen vermischen sich während der Bildung von Nukleosomen während der DNA-Replikation nicht. Stattdessen bleiben Oktameter der vor der Replikation vorhandenen Histone intakt und werden auf den Tochter-DNA-Duplex übertragen, während neue Histone auf nukleosomenfreien DNA-Regionen zu völlig neuen Kernpartikeln zusammengesetzt werden.

2) Fibrille (30 nm)

Einbauart des Magnetventils: Spirale, Zickzack-Anordnung (eine Windung – 6 Nukleosomen). Es wird angenommen, dass Histon H1 die Interaktion zwischen benachbarten Nukleosomen gewährleistet, indem es sie nicht nur näher bringt und verbindet, sondern auch die Bildung einer kooperativen Bindung zwischen benachbarten Nukleosomen fördert, was zur Bildung einer engen Helix führt. (Packungsdichte – 40)

Es wurde gezeigt, dass die Chromatinfibrille einen Durchmesser von 30 nm hatte. kann seinen Durchmesser reversibel verändern: Wird zu einer 10 nm dicken Fibrille, wenn Chromatinpräparate in entionisiertes Wasser überführt werden.

Zweite Installationsart: 25–30 nm große Nukleomere, kugelförmige Packung. 40-fache DNA-Verdichtung.

Anordnung von fast zwei DNA-Windungen entlang der Peripherie des Nukleosomenkerns

Modell mit unregelmäßigem Magnetventil: Die Anzahl der Nukleosomen pro Windung der Helix ist nicht streng konstant, was zu einem Wechsel von Regionen mit mehr oder weniger vielen Nukleosomen pro Windung führen kann.

3) Chromomere (60-80 nm)

Loop-Styling-Modell. Durchschnittliche Schleifengröße– 60 KB

Anzahl der Schleifen im Socket – 15-80.

Die Basis der Schleifen ist im Zellkern an Stellen verankert, an denen sich Nicht-Histon-Proteine ​​befinden.

4) Chromonema (100 nm)

Bei Pflanzen kann es in Interphase-Kernen, bei Tieren in der Telophase während des Dekodensationsprozesses beobachtet werden.

5) Chromatid.

Im Zellkern sind auch Nicht-Histon-Proteine ​​vorhanden:

1) SIR (stiller Informationsregler)

Proteine, die mit Heterochromatin interagieren, modifizieren den N-Terminus von Histonen, Chromatininaktivierung.

2) H3-CENPA (Zentromer-Protein)

im Zentrum lokalisiert, konstitutives Heterochromatin, stabile Inaktivierung.

3) HP1 (Heterochromatin-Protein 1)

4) HP1+H3+Methyltransferase+Deacetylase (Entfernung von Acetylgruppen) = Unterdrückung der Transkription.

5) Im Bereich des Kinetochors wird eine Strukturformation beobachtet – eine Krone. Es enthält viele Proteine, die Funktion der meisten davon ist unbekannt.

6) HMG-Proteine ​​(„Jones-Proteine“) – High Mobility Group

Wichtige HMG-Proteine: HMG-1, HMG-2, HMG-14, HMG-17. Sie sind Transkriptionsregulatoren.

Modelle der Chromosomenstruktur:

1) Modell aus verwickelten Fäden

2) Chaotisches Modell

3) Schleifenmodell

4) Magnetventilmodell

Das genetische Material eukaryotischer Organismen ist sehr komplex organisiert. Im Zellkern befindliche DNA-Moleküle sind Teil einer speziellen Mehrkomponentensubstanz – Chromatin.

Definition des Konzepts

Chromatin ist das Material des Zellkerns, das Erbinformationen enthält. Dabei handelt es sich um einen komplexen Funktionskomplex aus DNA mit Strukturproteinen und anderen Elementen, die die Verpackung, Lagerung und Umsetzung des karyotischen Genoms gewährleisten. In einer vereinfachten Interpretation ist dies die Substanz, aus der Chromosomen bestehen. Der Begriff kommt vom griechischen „chrom“ – Farbe, Lack.

Das Konzept wurde bereits 1880 von Fleming eingeführt, es gibt jedoch immer noch Debatten darüber, was Chromatin im Hinblick auf seine biochemische Zusammensetzung ist. Die Unsicherheit betrifft einen kleinen Teil der Komponenten, die nicht an der Strukturierung genetischer Moleküle beteiligt sind (einige Enzyme und Ribonukleinsäuren).

In der Elektronenfotografie des Interphasenkerns wird Chromatin als zahlreiche Bereiche dunkler Materie dargestellt, die klein und verstreut oder zu großen dichten Clustern zusammengefasst sein können.

Durch die Chromatinkondensation während der Zellteilung entstehen Chromosomen, die auch im herkömmlichen Lichtmikroskop sichtbar sind.

Strukturelle und funktionelle Komponenten von Chromatin

Um zu bestimmen, was Chromatin auf biochemischer Ebene ist, extrahierten Wissenschaftler diese Substanz aus Zellen, überführten sie in Lösung und untersuchten in dieser Form die Zusammensetzung und Struktur ihrer Bestandteile. Dabei kamen sowohl chemische als auch physikalische Methoden zum Einsatz, darunter auch Elektronenmikroskopie-Technologien. Es stellte sich heraus, dass chemische Zusammensetzung 40 % des Chromatins werden durch lange DNA-Moleküle und fast 60 % durch verschiedene Proteine ​​repräsentiert. Letztere werden in zwei Gruppen eingeteilt: Histone und Nicht-Histone.

Histone sind eine große Familie grundlegender Kernproteine, die fest an die DNA binden und das Strukturgerüst des Chromatins bilden. Ihre Zahl entspricht in etwa dem Anteil genetischer Moleküle.

Der Rest (bis zu 20 %) der Proteinfraktion besteht aus DNA-bindenden und räumlich modifizierenden Proteinen sowie Enzymen, die an den Prozessen des Lesens und Kopierens genetischer Informationen beteiligt sind.

Neben den Grundelementen kommen im Chromatin in geringen Mengen Ribonukleinsäuren (RNA), Glykoproteine, Kohlenhydrate und Lipide vor, die Frage nach ihrem Zusammenhang mit dem DNA-Verpackungskomplex ist jedoch noch offen.

Histone und Nukleosomen

Das Molekulargewicht von Histonen variiert zwischen 11 und 21 kDa. Eine Vielzahl von Resten der basischen Aminosäuren Lysin und Arginin ergeben diese Proteine positive Ladung, wodurch die Bildung ionischer Bindungen mit entgegengesetzt geladenen Phosphatgruppen der DNA-Doppelhelix gefördert wird.

Es gibt 5 Arten von Histone: H2A, H2B, H3, H4 und H1. Die ersten vier Typen sind an der Bildung der Hauptstruktureinheit des Chromatins beteiligt – dem Nukleosom, das aus einem Kern (Proteinkern) und einer darum gewickelten DNA besteht.

Der Nukleosomenkern wird durch einen Oktamerkomplex aus acht Histonmolekülen dargestellt, zu dem das H3-H4-Tetramer und das H2A-H2B-Dimer gehören. Ein DNA-Abschnitt von etwa 146 Nukleotidpaaren wird auf die Oberfläche des Proteinpartikels gewickelt, bildet 1,75 Windungen und geht in eine Linkersequenz (ungefähr 60 bp) über, die die Nukleosomen miteinander verbindet. Das H1-Molekül bindet an die Linker-DNA und schützt sie so vor der Wirkung von Nukleasen.

Histone können verschiedene Modifikationen durchlaufen, wie z. B. Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, ADP-Ribosylierung und Wechselwirkung mit dem Ubiquitin-Protein. Diese Prozesse beeinflussen die räumliche Konfiguration und Packungsdichte der DNA.

Nicht-Histon-Proteine

Es gibt mehrere hundert Arten von Nicht-Histon-Proteinen verschiedene Eigenschaften und Funktionen. Ihr Molekulargewicht variiert zwischen 5 und 200 kDa. Eine besondere Gruppe besteht aus ortsspezifischen Proteinen, die jeweils zu einer bestimmten DNA-Region komplementär sind. Zu dieser Gruppe gehören 2 Familien:

• „Zinkfinger“ – erkennen Fragmente mit einer Länge von 5 Nukleotidpaaren;
• Homodimere – gekennzeichnet durch eine Helix-Turn-Helix-Struktur im mit der DNA verbundenen Fragment.

Am besten untersucht sind die sogenannten High Mobility Proteine ​​(HGM-Proteine), die ständig mit Chromatin assoziiert sind. Die Familie erhielt diesen Namen aufgrund von hohe Geschwindigkeit Bewegung von Proteinmolekülen in einem Elektrophoresegel. Diese Gruppe macht den Großteil der Nicht-Histon-Fraktion aus und umfasst vier Haupttypen von HGM-Proteinen: HGM-1, HGM-14, HGM-17 und HMO-2. Sie erfüllen strukturelle und regulatorische Funktionen.

Zu den Nicht-Histon-Proteinen gehören auch Enzyme, die für die Transkription (den Prozess der Synthese von Boten-RNA), die Replikation (Verdoppelung der DNA) und die Reparatur (Beseitigung von Schäden im genetischen Molekül) sorgen.

Ebenen der DNA-Verdichtung

Die Besonderheit der Chromatinstruktur besteht darin, dass DNA-Stränge mit einer Gesamtlänge von mehr als einem Meter in einen Kern mit einem Durchmesser von etwa 10 Mikrometern passen. Dies ist dank eines mehrstufigen Verpackungssystems genetischer Moleküle möglich. Allgemeines Schema Die Verdichtung umfasst fünf Ebenen:

1. nukleosomales Filament mit einem Durchmesser von 10–11 nm;
2. Fibrille 25–30 nm;
3. Schleifendomänen (300 nm);
4. 700 nm dicke Faser;
5. Chromosomen (1200 nm).

Diese Organisationsform sorgt für eine Verkürzung der Länge des ursprünglichen DNA-Moleküls um das Zehntausendfache.

Ein Faden mit einem Durchmesser von 11 nm wird durch eine Reihe von Nukleosomen gebildet, die durch DNA-Linker-Regionen verbunden sind. In einer elektronenmikroskopischen Aufnahme ähnelt eine solche Struktur Perlen, die an einer Angelschnur aufgereiht sind. Das Nukleosomenfilament faltet sich spiralförmig wie ein Solenoid und bildet eine 30 nm dicke Fibrille. An seiner Bildung ist Histon H1 beteiligt.

Die Magnetfibrille faltet sich zu Schleifen (auch Domänen genannt), die an der tragenden intranukleären Matrix verankert sind. Jede Domäne enthält 30 bis 100.000 Basenpaare. Dieser Verdichtungsgrad ist charakteristisch für Interphase-Chromatin.

Durch die Helikalisierung einer Domänenfibrille entsteht eine 700 nm dicke Struktur, die Chromatid genannt wird. Die beiden Chromatiden wiederum bilden die fünfte Ebene der DNA-Organisation – ein Chromosom mit einem Durchmesser von 1400 nm, das im Stadium der Mitose bzw. Meiose sichtbar wird.

Somit sind Chromatin und Chromosom Verpackungsformen des genetischen Materials, die davon abhängen Lebenszyklus Zellen.

Chromosomen

Ein Chromosom besteht aus zwei identischen Schwesterchromatiden, die jeweils aus einem superknäueligen DNA-Molekül bestehen. Die Hälften sind durch einen speziellen fibrillären Körper namens Zentromer verbunden. Gleichzeitig ist diese Struktur eine Verengung, die jedes Chromatid in Arme unterteilt.

Im Gegensatz zu Chromatin, einem Strukturmaterial, ist ein Chromosom eine diskrete Funktionseinheit, die nicht nur durch Struktur und Zusammensetzung, sondern auch durch einen einzigartigen genetischen Satz sowie eine gewisse Rolle bei der Umsetzung der Vererbungs- und Variabilitätsmechanismen gekennzeichnet ist der zellulären Ebene.

Euchromatin und Heterochromatin

Chromatin im Zellkern kommt in zwei Formen vor: weniger spiralförmig (Euchromatin) und kompakter (Heterochromatin). Die erste Form entspricht transkriptionell aktiven Bereichen der DNA und ist daher nicht so eng strukturiert. Heterochromatin wird in fakultatives (kann von einer aktiven in eine dichte inaktive Form übergehen, abhängig vom Stadium des Zelllebenszyklus und der Notwendigkeit, bestimmte Gene zu implementieren) und konstitutives (ständig verdichtetes) unterteilt. Während der mitotischen oder meiotischen Teilung ist das gesamte Chromatin inaktiv.

Konstitutives Heterochromatin kommt in der Nähe von Zentromeren und in den Endregionen des Chromosoms vor. Elektronenmikroskopische Ergebnisse zeigen, dass dieses Chromatin erhalten bleibt hochgradig Kondensation nicht nur im Stadium der Zellteilung, sondern auch während der Interphase.

Biologische Rolle von Chromatin

Die Hauptfunktion des Chromatins besteht darin, es dicht zu packen große Menge Genmaterial. Für das Funktionieren einer Zelle reicht es jedoch nicht aus, einfach DNA in den Zellkern zu platzieren. Es ist notwendig, dass diese Moleküle richtig „funktionieren“, das heißt, dass sie die in ihnen enthaltenen Informationen über das DNA-RNA-Protein-System übertragen können. Darüber hinaus muss die Zelle während der Teilung genetisches Material verteilen.

Die Chromatinstruktur erfüllt diese Aufgaben vollständig. Der Proteinteil enthält alle notwendigen Enzyme und ihre Strukturmerkmale ermöglichen es ihnen, mit bestimmten Abschnitten der DNA zu interagieren. Daher besteht die zweite wichtige Funktion des Chromatins darin, alle mit der Umsetzung des Kerngenoms verbundenen Prozesse sicherzustellen.

Im eukaryotischen Genom werden folgende Fraktionen unterschieden.

1. Einzigartig, d. h. Sequenzen, die in einer Kopie oder in mehreren Kopien vorhanden sind. In der Regel handelt es sich dabei um Cistrons – Strukturgene, die Proteine ​​kodieren.

2. Wiederholungen mit niedriger Frequenz – Sequenzen, die Dutzende Male wiederholt werden.

3. Wiederholungen mit mittlerer oder mittlerer Frequenz – Sequenzen, die hunderte und tausende Male wiederholt werden. Dazu gehören rRNA-Gene (beim Menschen sind es 200 pro Haploidensatz, bei Mäusen 100, bei Katzen 1000, bei Fischen und Blütenpflanzen Tausende), tRNA, Gene für ribosomale Proteine ​​und Histonproteine.

4. Hochfrequente Wiederholungen, deren Anzahl 10 Millionen (pro Genom) erreicht. Die DNA von Mäusen besteht zu 70 % aus einzigartigen Sequenzen, zu 20 % aus Wiederholungen mit niedriger und mittlerer Frequenz und zu 10 % aus Wiederholungen mit hoher Frequenz.

Wiederholungen bilden sogenannte Familien, worunter man eine Menge von Sequenzen versteht, die vollständig oder größtenteils zueinander homolog sind.

Aufgrund erheblicher Unterschiede in der Nukleotidzusammensetzung von Hochfrequenzwiederholungen und der restlichen DNA bilden sich bei der Zentrifugation in einem Dichtegradienten von Cäsiumchlorid häufig sogenannte Satellitenpeaks, die eine höhere oder niedrigere Auftriebsdichte aufweisen als der Rest der DNA. Dieser Teil des Genoms wird durch eine kleine (10...15) Anzahl von Familien kurzer (5...12 bp) Wiederholungen repräsentiert, die ausgedehnte Blöcke bilden. Innerhalb von Blöcken können Gruppen von Wiederholungen einzelner Familien einander abwechseln, sodass Satelliten-DNA eine Art Patchwork-Struktur aufweist. Die Hybridisierung von Fraktionen hochfrequenter Sequenzen mit DNA direkt auf Chromosomenpräparaten ermöglichte den Nachweis, dass diese Fraktion des Genoms in Regionen mit konstitutivem Heterochromatin lokalisiert ist, am häufigsten perizentromer oder telomer. Bereits in den 30er Jahren wurde gezeigt, dass diese Bereiche genetisch inert sind, also keine Gene enthalten. In Wirklichkeit können solch kleine Sequenzen, aus denen die Satelliten-DNA besteht, nichts anderes als Oligopeptide kodieren. Darüber hinaus werden heterochromatische Regionen nicht transkribiert. Somit wird im Fall von Hochfrequenz-DNA-Sequenzen die Identität der molekularen Organisation und der genetischen Eigenschaften eukaryontischer chromosomaler DNA offenbart. Es ist zu beachten, dass dieser Anteil bei der überwiegenden Mehrheit der Arten nicht mehr als 10 % des Genoms einnimmt. Verwandte Arten, zum Beispiel Maus und Ratte, haben völlig unterschiedliche Hochfrequenzsequenzen; bei der Ratte unterscheidet sich ihre Nukleotidzusammensetzung nicht von der Haupt-DNA, während das Mausgenom einen klaren AT-reichen Satelliten enthält. Dies bedeutet, dass Hochfrequenz-DNA während der Artbildung zu schnellen Veränderungen fähig ist.

Die restlichen 90 % des eukaryontischen Genoms, sein euchromatischer Teil, basieren auf dem Prinzip der Abwechslung (Interpersion) einzigartiger und sich wiederholender Sequenzen. Herkömmlicherweise gibt es zwei Haupttypen von Einstreuungen, die nach der Art benannt sind, bei der sie erstmals beschrieben wurden: Einstreuungen vom Typ „Xenopus“ (beim Krallenfrosch zu finden). Xenopus laevis) und der Drosophila-Typ (erstmals in der Fruchtfliege beschrieben). D. melanogaster). Ungefähr 50 % des Genoms Xenopus laevis einzigartige Sequenzen von 800...1200 bp. wechseln sich mit sich wiederholenden ab, deren durchschnittliche Größe 300 bp beträgt. In den übrigen Genomen des Typs „Xenopus“ betragen die Abstände zwischen benachbarten Wiederholungen deutlich mehr als 1...2 bp. Die Struktur des Xenopus-Genoms ist vor allem bei Tieren weit verbreitet. Auch Säugetiere und Menschen gehören zu dieser Art der Genomorganisation. Ein Merkmal des Genoms von Menschen und anderen Primaten sind eingestreute hochfrequente Wiederholungen von etwa 300 bp Länge. Beim Menschen enthalten diese Wiederholungen eine vom Restriktionsenzym Alu I geschnittene Stelle. Die Anzahl der Alu-ähnlichen Wiederholungen im menschlichen Genom erreicht 5 × 10 5 und einigen Daten zufolge sogar 10 6.

Alu-ähnliche Sequenzen in Primaten sind teilweise Duplikationen (Verdoppelungen) der B1-Sequenz im Nagetiergenom, die erstmals von G. P. Georgiev und seinen Kollegen beschrieben wurden.

U D. melanogaster Die Parameter der Interpersion unterscheiden sich stark von Arten mit dem Genomtyp „Xenopus“: sich wiederholende Sequenzen mit einer Länge von 5600 bp. wechseln sich mit einzigartigen ab, deren Länge mindestens 13.000 bp beträgt.

Es ist interessant, das festzustellen Stubenfliege Das Genom ist nach dem Typ „Xenopus“ geordnet. Diese Tatsache weist direkt darauf hin, dass im Laufe der Evolution im euchromatischen Teil des Genoms sehr schnelle Transformationen in der Art des Sequenzwechsels möglich sind. Vögel nehmen hinsichtlich der Interferenzparameter eine Zwischenstellung zwischen dem Typ „Xenopus“ und dem Typ „Drosophila“ ein. Wie Forschungsergebnisse zeigen den letzten Jahren Viele Tier- und Pflanzenarten können aufgrund ihrer Genomorganisation nicht streng in einen der beiden Typen eingeteilt werden. So gibt es in den Genomen von Säugetieren lange Wiederholungen – mehrere tausend Nukleotidpaare; in den Genomen von Lilien können bis zu 90 % der DNA durch sich wiederholende Sequenzen dargestellt werden. Beispielsweise enthält das Erbsengenom keine eindeutigen Sequenzen mit einer Länge von mehr als 300 bp.

Ein weiteres Merkmal wiederholter Sequenzen in eukaryotischen Genomen sind invertierte Wiederholungen oder Palindrome (siehe unten). Unter Renaturierungsbedingungen bilden sie nahezu augenblicklich Duplexstrukturen aus. Im Wesentlichen sind Palindrome Teil von Zwischenwiederholungen. Einige hochfrequente Wiederholungen im euchromatischen Teil des Genoms, beispielsweise bei Mitgliedern der Alu-Familien, können jedoch sowohl in direkter als auch in invertierter Position auftreten. Manchmal werden zwischen den invertierten Wiederholungen andere Sequenzen eingefügt.