Hühnerembryo. Methoden zur experimentellen Infektion von Hühnerembryonen

Zweck der Lektion: Schüler mit Methoden zur Infektion von Hühnerembryonen zur Kultivierung von Viren vertraut zu machen.

Ausrüstung und Materialien: Hühnerembryonen 9-12 Tage Inkubation, Ovoskop, Alkoholtupfer, Ständer für Embryonen, Pinzette, Schere, Klebeband, Nadeln, Spritzen, Bleistifte, Stanzen, Nadeln, Tabellen, Diagramme, Multimedia-Ausrüstung, Präsentationen MS Office Power Point zum Thema der Lektion.

Erklärung des Lehrers.

Die Infektionsmethode beeinflusst die Vermehrung von Viren in Embryonen erheblich. Vor der Infektion werden bebrütete Eier durchgeleuchtet und tote Eier getrennt. Auf den Schalen von Eiern mit lebenden Embryonen, die sich durch die rote Farbe der Blutgefäße und die Bewegung des Embryos auszeichnen, wird die Infektionsstelle mit einem Bleistift markiert.

Die Embryonen werden in einer sterilen Box mit Arbeitstisch, zwei Stühlen, Gasversorgung, Wasserversorgung und Vakuum infiziert. Die Infektion der Fruchthöhle erfolgt in einem abgedunkelten Raum. Arbeitsplatz sollte gut beleuchtet sein. Vor der Arbeit wird der Tisch desinfiziert. Um die Oberfläche von Eiern zu desinfizieren, bereiten Sie eine antiseptische Lösung (70 % Alkohol, 2 % Jodlösung) und einen mit Watte umwickelten Holzstab, eine gebogene Zahnsonde oder einen Bohrer zum Bohren vor. Eierschalen. Die Infektion der Eier erfolgt mit sterilen Tuberkulinisierungsspritzen und speziellen Nadeln. Die Infektionsstelle am Ei ist mit Paraffin gefüllt. Dazu werden Paraffinstäbchen vorbereitet: Ein Glasstab wird in ein mit geschmolzenem Paraffin gefülltes Reagenzglas eingeführt und darauf geachtet, dass er sich in der Mitte des Reagenzglases befindet, bis das Paraffin abkühlt.

Wenn ein Paraffinstab benötigt wird, werden die Wände des Reagenzglases auf einem Brenner erhitzt und das Paraffin mit einem Glasstab aus dem Reagenzglas gezogen. Halten Sie den Stab über die Flamme und schmelzen Sie die Menge Paraffin, die erforderlich ist, um das Loch im Ei zu schließen. Diese Methode ist sehr sauber und erzeugt keine Paraffindämpfe.

Zusätzlich werden in einer Box ein Glas mit sterilen Wattestäbchen, ein Glas mit einer 3%igen Natronlauge für gebrauchte Instrumente und ein Gefäß mit einer Chloraminlösung für gebrauchte Glasgegenstände auf den Arbeitstisch gestellt. Bei Bedarf können Sie einen Eierbecher, einen kleinen Emaillebecher und sterile Nährmedien vorbereiten. Der so vorbereitete Arbeitstisch wird 1-2 Stunden lang einer UV-Bestrahlung ausgesetzt.

Angesichts der Pathogenität der untersuchten Viren wird mit Maske, Gummihandschuhen und Schutzbrille gearbeitet.

Es gibt sechs Methoden zur Infektion von Embryonen. Die am häufigsten verwendete Infektion ist Allantoishöhle und auf der Chorioallantoismembran, seltener - in die Fruchthöhle und hinein Dottersack und sehr selten - in den Körper des Embryos und in die Blutgefäße des CAO. Die Wahl der Methode wird durch den Tropismus des Virus sowie den Zweck der Infektion bestimmt. Bei jeder Infektionsmethode werden 0,1–0,2 ml infektiöses Material injiziert.

Infektion in der Allantoishöhle.

Bei einer Infektion mit dieser Methode vermehren sich Influenzaviren, Newcastle-Krankheit, Pferde-Rhinopneumonie, vesikuläre Stomatitis usw. gut. Es gibt mehrere Varianten der Methode.

Erste Wahl. Der Embryo wird vertikal mit dem stumpfen Ende nach oben fixiert. In die Schale wird auf der Seite des Embryos und manchmal auf der dem Embryo gegenüberliegenden Seite, 5-6 mm über dem Rand der Luftkammer, ein Loch mit einem Durchmesser von etwa 1 mm gebohrt. Die Nadel wird parallel zur Längsachse bis zu einer Tiefe von 10-12 mm eingeführt (Abb. 16). Nach der Injektion des virushaltigen Materials wird die Nadel entfernt und das Loch in der Hülle mit einem Tropfen geschmolzenem sterilem Paraffin verschlossen.

Abbildung 16. Infektion in der Allantoishöhle (erste Option) (nach Nikolaou)

Zweite Option. Das in der Schale über der Luftkammer angebrachte Loch dient nur dazu, einen Teil der Luft entweichen zu lassen. Das Loch für die Infektion selbst wird im Bereich der avaskulären Zone der Chorioallantoismembran (CAO) auf der Seite des Embryos angebracht. Die Nadel wird maximal 2-3 mm tief eingeführt. Injizieren Sie eine infektiöse Flüssigkeit in einem Volumen von 0,1–0,2 ml und verschließen Sie das Loch mit Paraffin (siehe Abb. 17).

Infektion der Chorioallantoismembran.

Diese Methode zur Infektion von Hühnerembryonen wird häufig zur Kultivierung epitheliotroper und pantropischer Viren von Pocken, infektiöser Laryngotracheitis bei Vögeln, Staupe, Aujeszky-Krankheit, Blauzungenkrankheit usw. verwendet.

Eine solche Infektion kann durch eine natürliche oder künstliche Luftkammer erfolgen.

Für eine Infektion durch eine natürliche Luftkammer Der Embryo wird mit dem stumpfen Ende nach oben senkrecht auf ein Stativ gestellt und in der Schale gegen die Mitte der Luftkammer ausgeschnitten rundes Fenster mit einem Durchmesser von 15-20 mm. Durch dieses Fenster wird die Unterschalenmembran mit einer Pinzette entfernt. 0,2 mm einer virenhaltigen Suspension werden auf den freiliegenden Bereich des CAO aufgetragen (Abb. 18), das Loch wird mit einem Heftpflaster oder seltener mit einem mit geschmolzenem Paraffin verstärkten Deckglas verschlossen.

Infektion durch eine künstliche Luftkammer wird häufiger verwendet als das erste, da es den Kontakt des virushaltigen Materials mit einer größeren Oberfläche des CW gewährleistet und somit zur Bildung einer größeren Virusmenge führt.

Abbildung 17. Infektion eines Hühnerembryos in der Allantoishöhle (zweite Option) (nach Nikolaou)

Abbildung 18. Infektion bei KhAO durch eine natürliche Luftkammer (nach Nikolaou et al.)

Abbildung 19. Infektion eines Hühnerembryos bei KhAO durch eine künstliche Luftkammer (nach Nikolaou et al.)

Um einen Embryo mit dieser Methode zu infizieren, wird er horizontal mit dem Embryo nach oben in einen Ständer gestellt. In die Schale werden zwei Löcher gebohrt: eines klein über der Mitte der Luftkammer (zum Ansaugen von Luft) und das andere mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,5 cm seitlich, auf der Seite des Embryos. Die Komplexität der Methode besteht darin, dass Sie beim Bohren des zweiten Lochs zunächst vorsichtig ein Stück der Schale entfernen und dann die Schale mit einer Gleitbewegung, ohne die chemische Substanz zu beschädigen, zur Seite bewegen müssen, damit Luft durch das entstehende Loch strömen kann Defekt. Anschließend wird Luft aus der natürlichen Luftkammer mit einem Gummiball durch das erste Loch (Abb. 19, a) und anschließend durch das seitliche Loch abgesaugt Außenluft strömt nach innen und bildet eine künstliche Luftkammer, deren Boden das XAO ist (Abb. 19, b).

Durch das seitliche Loch wird eine infektiöse Flüssigkeit auf die Oberfläche des CAO aufgetragen und das Loch mit einem Stück Klebeband verschlossen. Das erste Loch muss nicht verschlossen werden, da die innere Schicht der Schalenmembran durch diese Infektionsmethode nicht beschädigt wird und weiterhin als Barriere für die Mikroflora fungiert Umfeld.

Die weitere Inkubation der mit dieser Methode infizierten Embryonen erfolgt in horizontaler Position mit der seitlichen Öffnung nach oben.

Infektion im Dottersack.

Meistens wird es zur Vermehrung von Chlamydien sowie von Viren der Marek-Krankheit, der Rhinopneumonie des Pferdes, der Blauzungenkrankheit von Schafen usw. verwendet. Sie infizieren Embryonen im Alter von 5 bis 7 Tagen und manchmal von 2 bis 3 Tagen (RIF). Valley-Fieber-Virus). Es werden zwei Infektionsmöglichkeiten genutzt.

Erste Wahl. Embryonen werden in vertikaler Position auf einem Stativ platziert. Über der Mitte der Luftkammer wird ein Loch in die Schale gebohrt und eine Nadel bis zu einer Tiefe von 3,5 bis 4 cm in einem Winkel von 45° zur vertikalen Achse in entgegengesetzter Richtung zum Standort des Embryos eingeführt (Abb. 20).

Abbildung 20. Infektion eines Hühnerembryos im Dottersack (nach Nicolaou et al.)

Zweite Option. Manchmal wird ein ähnlicher Infektionsweg bei einem horizontal auf einem Stativ montierten Embryo durchgeführt; In diesem Fall befindet sich der Embryo unten und das Eigelb darüber. Das Loch in der Schale wird mit einem Tropfen geschmolzenem Paraffin verschlossen.

Infektion in der Fruchthöhle.

Hierzu werden 6 bis 10 Tage alte Embryonen verwendet. Die Methode wird zur Kultivierung von Influenzaviren, Newcastle-Krankheit, Rhinopneumonie bei Pferden usw. verwendet. Es gibt zwei Infektionsmethoden.

Geschlossene Methode. Die Ansteckung erfolgt in einer abgedunkelten Box. Die Eizelle wird horizontal mit dem Embryo nach oben auf das Ovoskop gelegt. Eine Nadel mit stumpfem Ende wird durch ein Loch in der Schale über der Luftkammer in Richtung Embryo eingeführt. Der Beweis dafür, dass die Nadel in das Amnion eingedrungen ist, ist die Bewegung des fetalen Körpers in Bewegungsrichtung.

Offene Methode. Die Schale über der Luftkammer wird so geschnitten, dass ein Fenster mit einem Durchmesser von 1,5-2,5 cm entsteht. Durch dieses wird die Unterschalenmembran unter Augenkontrolle mit einer Pinzette entfernt. Dann wird eine anatomische (14 cm) Pinzette mit geschlossenen Backen geführt, die die Chorioallantoismembran in Richtung des Embryos drückt. Wenn die Pinzette dort ankommt, öffnen sich die Backen, greifen die Fruchtwassermembran zusammen mit dem CAO und ziehen sie zum Fenster. Halten Sie die Pinzette mit der darin fixierten Amnionmembran mit der linken Hand fest und führen Sie ein virushaltiges Material ein (Abb. 21). Anschließend werden alle Membranen abgesenkt, das Fenster mit einem Heftpflaster verschlossen und der Embryo in vertikaler Position inkubiert.

Abbildung 21. Infektion eines Hühnerembryos im Amnion offene Methode(nach Nikolaou et al.)

Infektion in den Blutgefäßen von XAO.

Bei der Ovoskopie 11–13 Tage alter Embryonen fällt ein großes Blutgefäß auf. Im weiteren Verlauf wird ein Teil der Schale entfernt, 1-2 Tropfen Alkohol aufgetragen, wodurch die Schalenmembran für eine Weile transparent wird. Unter Augenkontrolle mit einem Ovoskop wird die Nadel in das Gefäß eingeführt, was durch ihre Beweglichkeit bei kleinen seitlichen Bewegungen der Nadel bestätigt wird. Der freiliegende Bereich der Unterschalenmembran wird mit einem Stück Heftpflaster abgedeckt.

Das Einbringen des Materials in die Gefäße kann auch auf etwas andere Weise erfolgen: Die Schale über der Luftkammer wird abgeschnitten, die Unterschalenmembran mit Alkohol befeuchtet und das Material in die sichtbar gewordenen XAO-Gefäße eingebracht. Das Loch wird mit einem Stück sterilem Klebeband abgedeckt.

Die beschriebenen technischen Methoden zur experimentellen Infektion von Hühnerembryonen sind nicht die einzigen, sondern bieten verschiedene Möglichkeiten.

Infektion im Körper des Embryos.

Für die Infektion werden Embryonen verwendet, die 7–12 Tage alt sind. Es gibt zwei bekannte Versionen der Methode.

Erste Wahl. Infizieren Sie auf die gleiche Weise wie im Amnion auf geschlossene Weise, mit dem einzigen Unterschied, dass sie eine scharfe Nadel nehmen und bei einem Ovoskop der Indikator dafür, dass die Nadel in den Körper eindringt, die Unterordnung des Embryos unter die Bewegungen der Nadel ist.

Zweite Option. Sie infizieren das Amnion auf die gleiche Weise wie beim offenen Weg: Durch ein Fenster in der Schale wird der Körper des Embryos mit einer Pinzette hochgezogen. Das Material wird in das Gehirn oder bestimmte Bereiche des Körpers injiziert. Bei solchen Infektionsmethoden kommt es zu einem erheblichen Prozentsatz des unspezifischen Embryotods.

Virusansammlung im Hühnerembryo

Vor der weiteren Inkubation schreiben sie auf die Schale von Hühnerembryonen, die mit irgendeiner Methode infiziert wurden, mit einem einfachen (Graphit-)Stift, womit der Embryo wann infiziert ist und gegebenenfalls weitere Informationen. Infizierte Hühnerembryonen werden zur weiteren Inkubation in einen Thermostat gegeben, wobei die eingeführten Viren reproduziert und in den entsprechenden Strukturen angereichert werden. Die Inkubationstemperatur von Embryonen variiert zwischen 33 und 38 °C, abhängig von den Eigenschaften des Virus, mit dem die Infektion durchgeführt wurde. Die Embryonen werden ständig überwacht, mit einem Ovoskop untersucht und tote Embryonen werden ausgewählt.

Der Tod von Embryonen in den ersten 24 Stunden nach der Infektion ist meist auf die Vermehrung von Pilzen, die mit dem Inokulum in den Embryo eingeführte bakterielle Mikroflora oder eine Verletzung während der Infektion zurückzuführen. Dieser Tod gilt als unspezifisch. In mehr späte Termine Embryonen sterben in der Regel durch Virusvermehrung in Embryonen. Sobald tote Embryonen entdeckt werden, werden diese sofort in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von 4 °C überführt. Solche Bedingungen tragen einerseits zur Erhaltung der Aktivität des im Embryo angesammelten Virus bei, andererseits zur Verdichtung des Gewebes und zur Entleerung der Blutgefäße, was die spätere Dissektion erheblich erleichtert.

Embryonen werden inkubiert, bis eine maximale Virusanreicherung erreicht ist. Dieser Zeitraum ist für jedes Virus und sogar jeden Stamm spezifisch und variiert zwischen 2 und 7-8 Tagen. So sind es für den Newcastle-Krankheitsvirus-Stamm H 2-3 Tage, für den gleichen Virusstamm B - 5 Tage, für das aviäre infektiöse Laryngotracheitis-Virus - 5 Tage usw. Anschließend werden alle Embryonen durch Abkühlen bei 4 °C abgetötet mindestens 3-4 Stunden und geöffnet.

Entkeimte Eier.

Die Methode basiert auf der Entnahme des Embryos aus der Eizelle während der Zeit, in der die Chorioallantoismembran von innen vollständig an ihre Schale angrenzt. Fügt man einem solchen Ei einen Nährboden hinzu, entsteht eine Art Gewebekultur, in der sich das Virus vermehren kann. Die Methode hat eine Reihe von Vorteilen: Sie ermöglicht die Gewinnung eines reineren Virus als im Allantois-Fruchtwasser, was für die Reduzierung der allergenen Eigenschaften von aus diesem Material hergestellten Impfstoffen wichtig ist; Das Fehlen des Dottersacks und damit der darin enthaltenen spezifischen Antikörper ermöglicht es einigen Viren, sich besser zu vermehren. In einigen Fällen liefert diese Methode gute Ergebnisse bei diagnostischen Arbeiten, da große Mengen des Testmaterials eingebracht werden können, was die Möglichkeit einer Virusisolierung erhöht.

Die Methode wurde bereits 1949 von Bernkopf vorgeschlagen, findet jedoch aufgrund von Anwendungsschwierigkeiten keine breite Anwendung. Diese Schwierigkeiten hängen mit der Eigenschaft der Chorioallantoismembran zusammen, sich während der Inkubation von der Hülle zu lösen, was den Wert der Kultur verringert und die Manipulation der Gewinnung des Virus und des Austauschs des Nährmediums erschwert.

E. Groiel (1963) führte eine Reihe von Modifikationen ein, die diese Schwierigkeiten beseitigten. Er schlug vor, 15 Tage alte oder noch ältere Eier zu verwenden, die während der Brutzeit häufig gewendet werden sollten, um eine gleichmäßige Entwicklung der Schale auf der Eierschale zu gewährleisten. Bei Durchleuchtung werden die Grenzen der Luftkammer angezeigt. 0,5 cm oberhalb dieser Linie wird die Schale abgesägt, auf den Rand der Schale wird geschmolzenes Paraffin (56-58 C°) gegossen, das aushärtet und den Rand des Eies fixiert. Dann schneiden rundes Loch in der Schale über dem Embryo, so dass rundherum ein schmaler Rand verbleibt. Der nächste Schritt besteht darin, den Embryo vorsichtig aus der Eizelle zu entfernen. In diesem Fall sollte das Ei horizontal gehalten und langsam gedreht werden. Auf diese Weise werden die Gefäße, die den Embryo mit dem CAO verbinden, gefunden und mit einer Schere durchtrennt. Wird das Ei senkrecht gehalten, dann zieht der Embryo mit seiner Masse die Schale zurück und reißt sie meist im Bereich des scharfen Endes des Eies ab. Bereits das Eindringen einer geringen Flüssigkeitsmenge zwischen den chemischen Substanzen und der Schale führt zu einer vollständigen Ablösung der Schale innerhalb von 1-2 Tagen.

Nach der Entnahme des Embryos wird die das Ei auskleidende Membran mehrmals mit auf 4-0°C gekühlter Kochsalzlösung gewaschen, bis die Flüssigkeit klar wird. Anschließend werden 20 ml eines auf 37 °C erhitzten Nährmediums in die Eierhöhle eingebracht und das Ei mit einer sterilen Gummikappe verschlossen, nachdem es zuvor in Paraffin getaucht wurde. Ein im Ei eingebettetes Röhrchen mit Gummistopfen ermöglicht sowohl die Entnahme als auch die Verabreichung von Flüssigkeit ohne das Risiko einer bakteriellen Kontamination. Ein solches biologisches Objekt bleibt mehrere Tage lang lebensfähig.

Nach der Methode von Yoshino und anderen wird der Hohlraum entkeimter Eier mit einer Lösung von Agar in Hanks-Lösung gefüllt. Entkeimte Eier werden durch ein Röhrchen in der Kappe infiziert.

Kontrollfragen:

1. Die Struktur eines Hühnerembryos.

2. Warum werden Hühnerembryonen in der Virologie verwendet?

3. Wie ist der Aufbau eines sich entwickelnden Hühnerembryos?

Zweck der Lektion

Schüler mit Methoden zur Auswahl von Hühnerembryonen für die Kultivierung von Viren vertraut machen.

Ausrüstung und Materialien

Hühnerembryonen 9-12 Tage Inkubationszeit, Ovoskop, Alkoholtupfer, Embryoständer, Pinzetten, Scheren, Klebeband, Nadeln, Spritzen, Bleistifte, Stanzen, Nadeln, Tabellen, Diagramme, Multimedia-Ausrüstung, Präsentationen MS Office Power Point zum Thema der Lektion.

Methodik der Unterrichtsdurchführung und Richtlinien Zu diesem Thema

Erklärung des Lehrers

Die Kultivierung von Viren auf Hühnerembryonen ist die zugänglichste und bequemste Methode zur primären Isolierung des Virus. Die Anwendung dieser Infektionsmethode hat gegenüber anderen Methoden eine Reihe von Vorteilen gezeigt. Zur Infektion werden Embryonen mit einer Inkubationszeit von 5–12 Tagen verwendet.

VOR- UND NACHTEILE VON HÜHNEREMBRYONEN ALS BIOLOGISCHE OBJEKTE

Die Kultivierung von Viren in Hühnerembryonen ist die zugänglichste und bequemste Methode zur primären Isolierung von Viren aus kranken Tieren und Gegenständen Außenumgebung und zur anschließenden Kultivierung von Viren im Labor. Diese Methode wird häufig zur Identifizierung von Viren und Antikörpern sowie zur Herstellung von Impfstoffen und Diagnostika eingesetzt. Die Praxis hat eine Reihe von Vorteilen dieser Methode gegenüber der Kultivierung von Viren in Labortieren gezeigt. Es ist bekannt, dass weiße Mäuse, die in virologischen Studien häufig verwendet werden, spontan mit einer Reihe von Virusinfektionen infiziert werden können: Ektromelie, lymphozytäre Choriomeningitis, Taylor-Enzephalitis, virale Pneumonie, Sendai-Virus und andere, was die Arbeit äußerst erschwert und häufig dazu führt zu falschen Schlussfolgerungen bei der Bewertung der erzielten Ergebnisse. Ergebnisse. Durch die Kultivierung von Viren auf Hühnerembryonen werden die oben genannten Schwierigkeiten weitgehend beseitigt. Zudem kann aus einem Hühnerembryo eine deutlich größere Virusmenge gewonnen werden als aus Labortieren. Der Hühnerembryo ist lebensfähiger und widerstandsfähiger gegen verschiedene Arten von Einflüssen, die beim Einbringen des Testmaterials unvermeidlich sind. Mit einer bekannten Fähigkeit, mit Embryonen zu arbeiten und die Regeln der Asepsis einzuhalten, ist ihr Tod unbedeutend. Die größte Verschwendung von Embryonen entsteht beim Einbringen des Materials in die Fruchthöhle und den Dottersack, aber selbst in diesen Fällen überschreitet sie 10–15 % nicht, wenn die notwendigen Inkubationsbedingungen erfüllt sind.

Hühnerembryonen als lebendes System gelangten in den 30er Jahren des 20. Jahrhunderts in die virologische Praxis. Ihr Einsatz hat das Spektrum der im Labor gezüchteten Viren erweitert und ermöglicht eine erfolgreichere Lösung der Probleme der Virologie, da Hühnerembryonen gegenüber Labortieren eine Reihe von Vorteilen haben: 1) Die Schale und die Unterschalenmembran schützen die Embryo durch bakterielle Infektion aus der äußeren Umgebung; 2) Ein wichtiger Vorteil von Embryonen ist auch ihre hohe Empfindlichkeit gegenüber einer Vielzahl von Viren, was durch die unzureichende Entwicklung von Schutzmechanismen erklärt wird; 3) Hühnerembryonen sind aufgrund der Entwicklung eines breiten Netzwerks von Geflügelfarmen und Brütereien ein leicht zugängliches Objekt; 4) Hühnerembryonen sind wirtschaftlich und erfordern keine Pflege oder Fütterung.

Die Hauptnachteile sind: 1) die Unfähigkeit, die Sterilität dieses lebenden Systems vollständig zu gewährleisten, da Embryonen in ihrem Inhalt Viren und andere Krankheitserreger tragen können (Viren der infektiösen Hühnerbronchitis, Newcastle-Krankheit, Influenza, Leukämie, Chlamydien und Mykoplasmen). Ihre Anwesenheit kann die Ergebnisse der Studie verfälschen; 2) Hühnerembryonen sind nicht gegenüber allen Viren empfindlich.

ZWECKE DER VERWENDUNG VON HÜHNEREMBRYONEN

Hühnerembryos werden in der Virologie hauptsächlich für die gleichen Zwecke wie Labortiere verwendet, nämlich:

– Nachweis des aktiven Virus durch Bioassay im pathologischen Material;

– primäre Isolierung des Virus. Viren, die bei Vögeln Krankheiten verursachen, sowie einige Säugetierviren werden effektiv isoliert und auf Hühnerembryos kultiviert;

– Virenhaltung im Labor;

– Titration von Viren;

– Anreicherung des Virus für Laborforschung und Beschaffung von Impfstoffen;

– als Testobjekt in der Neutralisationsreaktion.

ANFORDERUNGEN AN HÜHNEREMBRYONEN

Eier müssen aus landwirtschaftlichen Betrieben stammen, die frei von Viruserkrankungen sind. Befruchtete Eier, selbst von klinisch gesunden Hühnern, können verschiedene Viren enthalten, die bei diesen Vögeln vorkommen: Newcastle-Krankheit, infektiöse Bronchitis, infektiöse Laryngotracheitis, Enzephalomyelitis, Parainfluenza-2, Polyarthritis, Pocken, Arboviren, Adenoviren usw. Das Vorhandensein dieser Viren kann, können einerseits zu Diagnosefehlern führen und andererseits aufgrund des Interferenzphänomens zur Unterdrückung der Vermehrung des in der Untersuchungsprobe befindlichen Virus führen. Embryonen, die kein Virus enthalten, aber von Hühnern stammen, die asymptomatisch mit bestimmten Viren infiziert sind, können aufgrund des Vorhandenseins spezifischer Antikörper, die von der Mutter mit dem Eigelb gewonnen werden, auch weniger empfindlich oder völlig unempfindlich gegenüber den Auswirkungen eines bestimmten Virus sein. Für eine erfolgreiche Isolierung des Virus ist es erforderlich, dass die Hühner, deren Embryonen für die Arbeit verwendet werden, nicht gegen die Krankheit geimpft sind, deren Erreger gesucht wird. Eierschalen müssen unpigmentiert und sauber sein (können nicht gewaschen werden). Das Alter des Embryos muss übereinstimmen gewählte Methode Infektion.

Um eine normale Entwicklung der Embryonen in befruchteten Eiern während der Inkubationszeit zu gewährleisten, ist es notwendig, eine bestimmte Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Sich entwickelnde Embryonen vertragen eine Überhitzung deutlich schlechter als eine Abkühlung. Daher verursacht ein kurzfristiger (innerhalb weniger Stunden) Ausfall der Heizungsanlage keinen großen Schaden. Für eine längere Pause ist eine Erwärmung erforderlich.

Bruteier benötigen freien Zugang frische Luft, das durch Lüftungsschlitze eintritt. Sie müssen immer offen sein. Ein Ei verbraucht, wie allgemein angenommen wird, 1 Liter Sauerstoff pro Tag, was nicht verwunderlich ist, wenn man sich an die schnelle Entwicklung des Embryos während der 21-tägigen Inkubation erinnert. Deshalb sollten Eier nicht dicht nebeneinander oder übereinander gelegt werden. Herkömmliche Thermostate sind zum Ausbrüten von Eiern nicht geeignet. Sie können für diese Zwecke nur im äußersten Notfall verwendet werden, aber gleichzeitig häufig lüften und ein Gefäß mit Wasser hineinstellen, um die erforderliche Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten.

Zur Inkubation gelegte Eier werden nach 3–5 Tagen mit einer speziellen Tischlampe oder einer Handlampe (sofern die Eier nicht aus der Brutschale genommen werden) untersucht, um unbefruchtete Eier auszuwählen. Livorno-Eier eignen sich am besten für virologische Arbeiten, da ihre dünne weiße Schale eine bessere Sicht auf den Inhalt ermöglicht. Eier, die unbefruchtet sind oder tote Embryonen enthalten, werden aus dem Inkubator entfernt. Der Anteil befruchteter Eier variiert stark und hängt von vielen Faktoren ab, unter anderem von der Jahreszeit: Im Frühling ist er am höchsten, im Winter am niedrigsten.

Am Tag der geplanten Infektion werden die Embryonen zum zweiten Mal gescannt. Dieser Zeitraum hängt von der Art des Virus sowie dem Weg seiner Einschleppung ab. Die Infektionsstelle wird mit einem normalen Bleistift (kein Tintenstift) auf der Schale markiert.

STRUKTUR DES HÜHNEREMBRYOS

Typischerweise legt ein Huhn ein befruchtetes Ei, in dem sich der Embryo im Blastula- oder frühen Gastrula-Stadium befindet. Wenn ein Ei auf eine Temperatur nahe der Körpertemperatur des Huhns erhitzt wird, weitere Entwicklung Embryo (Abb. 15). Im Zeitraum vom 5. bis 12. Inkubationstag können Hühnerembryonen zur Infektion mit Viren eingesetzt werden.

Abbildung 15 – Schematischer Schnitt eines Hühnerembryos am 8. Tag der Inkubation: 1 – Schale; 2 – Unterschalenmembran; 3 – Chorioallantoismembran; 4 – Allantoishöhle; 5 – Dottersack; 6 – Eiweiß; 7 – Luftkammer; 8 – Körper des Embryos; 9 – Fruchthöhle

Ein Ei mit einem sich entwickelnden Hühnerembryo ist außen mit einer harten, porösen Schale bedeckt, an der die Unterschalenmembran fest anliegt. Letzteres ist am stumpfen Ende des Eies in zwei Blätter geteilt, zwischen denen sich eine Luftkammer bildet. Der Körper des Embryos liegt exzentrisch im Ei, wobei der Rücken näher an der Schale liegt und der Kopf zur Luftkammer zeigt. Der Embryo wird in das Fruchtwasser eingetaucht, das die Fruchthöhle füllt, und ist über eine Nabelschnur mit dem Eigelb verbunden. Auch das Eigelb liegt exzentrisch und relativ zum Embryo, als ob es auf der anderen Seite der Längsachse wäre.

Direkt unter der Schalenmembran befindet sich eine Allantoishöhle, die das Fruchtwasser und den Dottersack bedeckt und am 10.-11. Tag im scharfen Ende des Eies verschlossen ist. Während der Entwicklung verschmilzt die Allantoismembran mit dem Chorion und bildet eine einzige Chorioallantoismembran (CAO). Am scharfen Ende des Eies befindet sich der Rest des Proteins.

Die Infektion des einen oder anderen Teils des Embryos erfolgt während der Zeit seiner maximalen Entwicklung, wenn die Anzahl der empfindlichen Zellen am größten ist.

Während des Inkubationsprozesses verändert sich die Größe der embryonalen Strukturen, was größtenteils durch ihren funktionellen Zweck erklärt wird und das optimale Alter des Embryos für eine Infektion bestimmt.

Der Dottersack ist also wie ein Reservoir Nährstoffe hat zu Beginn der Inkubation das größte Volumen und nimmt dann (nach dem 12. Tag) mit der Entwicklung des Embryos ab. Infizieren Sie den Dottersack vom 5. bis 7. Tag der Inkubation.

Die Fruchthöhle, die eine Pufferumgebung für die Entwicklung des Embryos darstellt, bedeckt ihn bereits am 5. Tag der Inkubation. Die durchschnittliche Flüssigkeitsmenge beträgt zur Mitte der Inkubationszeit etwa 1 ml.

Zur Infektion der Fruchthöhle werden Embryonen im Alter von 6–10 Tagen verwendet.

Die Allantoishöhle dient der Sammlung von Stoffwechselprodukten; darin reichern sich Harnsäuresalze, Phosphor- und Stickstoffverbindungen an. Während des Wachstums und der Entwicklung des Embryos wird die Allantoisflüssigkeit sauer. Maximale Größen Die Allantoishöhle erreicht ihren Ursprung am 9.–12. Tag der Embryonalentwicklung, daher erfolgt die Infektion in der Allantoishöhle hauptsächlich am 9.–11. Tag der Inkubation.

Die Chorioallantoismembran ist reich an Blutgefäßen, die eng an der Innenfläche der porösen Hülle anliegen, mit Sauerstoff gesättigt sind und ihn dem Körper des Embryos zuführen und dabei die Funktion des Atmungsorgans des Embryos erfüllen. CAO erreicht seine maximale Entwicklung am 11.-13. Tag. Die Infektion der Chorioallantoismembran erfolgt am 10.-12. Inkubationstag.

VORBEREITUNG VON HÜHNEREMBRYONEN AUF EINE INFEKTION

Embryonen werden aus der Brutstätte transportiert, ohne unterwegs gekühlt zu werden. Im Labor werden Embryonen in einem Thermostat bei einer Temperatur von 37 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 60–70 % inkubiert, was durch das Stellen offener Weithalsgefäße mit Wasser in den Thermostat erreicht wird. Belüftungslöcher Thermostate müssen geöffnet sein. Embryonen werden mit der Luftkammer nach oben in spezielle Ständer gelegt. Es wird empfohlen, den Embryonen zu ermöglichen, sich innerhalb von 24 Stunden vor der Infektion an die neuen Bedingungen anzupassen und ihre Funktionen nach dem Transportstress zu normalisieren. Wenn das Labor über eine eigene Brüterei verfügt, können die vom Huhn gelegten befruchteten Eier innerhalb von 10 Tagen dort abgelegt werden.

Die Vorbereitung von Hühnerembryonen auf eine Infektion umfasst die Ovoskopie und Desinfektion der Schale sowie eine entsprechende Vorbereitung des Arbeitsplatzes. Beim Ovoskopieren werden Eier gegen eine ausreichend helle Lichtquelle (Ovoskop) betrachtet, wodurch auf der unbeleuchteten Seite der Schale Schatten von inneren Strukturen entstehen (Abb. 16). Das Ovoscoping wird in einem abgedunkelten Raum durchgeführt. Gleichzeitig werden auf der Schale mit einem Graphitstift der Rand der Luftkammer, die Lage des Embryos und ein 0,5 x 0,5 cm großer Abschnitt der avaskulären Zone markiert. Diese Markierungen dienen als Orientierung bei der Auswahl die Stelle zum Einbringen des virushaltigen Materials. Bei der Ovoskopie wird auch festgestellt, ob der Embryo lebt oder tot ist. Embryonen werden gezeigt aktive Bewegungen Bei guter Blutversorgung der Gefäße des CAO gelten sie als lebendig.

Abbildung 16 – Ovoskopie eines Hühnerembryos am 10. Tag der Inkubation. Es sind Schatten sichtbar: 1 – Embryo; 2 – Dottersack; 3 – Blutgefäße XAO; 4 – Luftkammer; 5 – Eichhörnchen

Hühnerembryonen werden unter aseptischen Bedingungen (vorzugsweise in einer Box) infiziert. In der Vorbox werden die Embryonenhüllen mit jodiertem Alkohol behandelt, in der Box werden sie dann erneut abgewischt und manchmal auch flambiert – behandelt mit der Flamme eines mit Alkohol befeuchteten Tupfers.

Embryonen werden in speziellen Trägern fixiert, die in einer Emailleküvette auf einem mit einer Desinfektionslösung befeuchteten 3-4-lagigen Mulltuch installiert sind.

Bei der Arbeit werden durch Kochen sterilisierte Werkzeuge verwendet. Sie werden in ein Glas mit Alkohol gegeben und vor jeder Wiederverwendung mit einer Brennerflamme verbrannt.

Demonstration

a) klinische Krankheitszeichen bei infizierten Versuchstieren; b) Methoden zur Tötung von Labortieren; c) Autopsietechniken (die Aufmerksamkeit der Studierenden auf den Zustand innerer Organe lenken) und Methoden zur Gewinnung virushaltigen Materials; d) Techniken zur Anfertigung von Gehirnabdrücken; e) Maßnahmen zur Desinfektion des Arbeitsplatzes und der Leiche nach der Autopsie eines infizierten Tieres.

Aufgaben

1.Untersuchen Sie die Struktur eines Hühnerembryos.

2. Führen Sie eine Ovoskopie eines Hühnerembryos durch, bestimmen Sie seine Lebensfähigkeit und markieren Sie die Grenzen der Schatten natürlicher Formationen.

3. Bereiten Sie Hühnerembryonen auf die Infektion vor.

Selbstständige Arbeit Studenten

a) Erkennung der von jedem Schüler infizierten Mäuse durch Farbmarkierung, Analyse ihres klinischen Zustands, Tötung, Fixierung in einer Küvette mit Wachsboden (Paraffin), Autopsie; b) Analyse pathologischer Veränderungen, Gewinnung virushaltigen Materials (Parenchymorgane), schichtweise Erstellung von Gehirnabdrücken.

Die Schüler führen eine Ovoskopie eines Hühnerembryos durch, bestimmen seine Lebensfähigkeit und markieren die Grenzen der Schatten natürlicher Formationen.

Zusammenfassung der Lektion

Aufgabe für die nächste Lektion

Kontrollfragen

1. Die Struktur eines Hühnerembryos.

2. Warum werden Hühnerembryonen in der Virologie verwendet?

3. Wie ist der Aufbau eines sich entwickelnden Hühnerembryos?

Je nach Virustyp und Infektionsmethode werden Embryonen im Alter von 8 bis 14 Tagen verwendet. Die Fortpflanzung bei Hühnerembryonen erfolgt in verschiedenen Teilen des Embryos. Infektionsmethoden: auf der Chorioallantoismembran, in der allotonischen und amnionischen Membran, Dottersack, Embryokörper.

29.Gewebekulturen.

Abhängig von der Präparationstechnik gibt es 3 Arten von Zellen:

Einschichtiges Glas kann sich auf der Oberfläche von chemisch neutralem Glas in Form einer Monoschicht abbilden;

Suspension, die sich über das gesamte Volumen des Nährmediums verteilt;

Organe sind ganze Teile von Organen und Geweben, die ihre ursprüngliche Struktur behalten.

Die Vorbereitung einer primären Zellkultur besteht aus mehreren Schritten: Mahlen des Gewebes, Abtrennen der Zellen und Waschen der resultierenden Suspension von Trypsin.

Indikation:

- zytopathischer Effekt - morphologische Veränderungen in Zellen, die unter dem Mikroskop sichtbar sind, bis hin zur Abstoßung vom Glas.

Bei viralen Einschlüssen handelt es sich um eine Ansammlung viraler Partikel oder eine Trennung viraler Komponenten im Zytoplasma oder Zellkern.

Plaques sind begrenzte Bereiche, die aus degenerativen Zellen bestehen. Sie sind als helle Flecken vor dem Hintergrund farbiger Zellen sichtbar.

Farbtest

Unter Hämadsorption versteht man die Fähigkeit von Zellkulturen, rote Blutkörperchen an ihrer Oberfläche zu adsorbieren.

Interferenz.

30. Klassifizierung, chemische Zusammensetzung von Bakteriophagen.

Bakteriophagen sind bakterielle Viren, die die Fähigkeit besitzen, in Bakterienzellen einzudringen und deren Auflösung zu bewirken. Sie haben die Form einer Kaulquappe, einige sind kubisch-fadenförmig. Sie bestehen aus einem ikosaedrischen Kopf und einem Schwanz. Im Inneren des Schwanzfortsatzes befindet sich ein zylindrischer Stab, außen eine Hülle, der Fortsatz endet in einer sechseckigen Grundplatte mit kurzen Stacheln. Phagen bestehen aus Nukleinsäure und Protein. Bei spermienförmigen Phagen ist die doppelsträngige DNA im Inneren des Kopfes dicht in einer Helix gepackt. Proteine ​​sind Teil der Hülle. Neben Strukturproteinen sind auch interne Proteine ​​mit assoziiert Nukleinsäure und Enzymproteine, die an der Interaktion des Phagen mit der Zelle beteiligt sind.

31. Der Prozess der Interaktion zwischen virulenten Phagen und einer auf sie empfindlichen Bakterienzelle

Die Zahl virulenter Phagen kann sich während des Lysezyklus nur erhöhen. Der Interaktionsprozess zwischen einem virulenten Bakteriophagen und einer Zelle besteht aus mehreren Phasen: Adsorption des Bakteriophagen an der Zelle, Eindringen in die Zelle, Biosynthese von Phagenkomponenten und deren Zusammenbau sowie Freisetzung von Bakteriophagen aus der Zelle.

Bakteriophagen heften sich zunächst an phagenspezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der Bakterienzelle. Der Phagenschwanz löst mit Hilfe von an seinem Ende befindlichen Enzymen (hauptsächlich Lysozym) lokal die Zellmembran auf, zieht sich zusammen und die im Kopf enthaltene DNA wird in die Zelle injiziert, während die Proteinhülle des Bakteriophagen draußen bleibt. Injizierte DNA bewirkt eine völlige Umstrukturierung des Zellstoffwechsels: Die Synthese von bakterieller DNA, RNA und Proteinen stoppt. Die DNA des Bakteriophagen beginnt mit der Transkription mithilfe seines eigenen Transkriptase-Enzyms, das nach dem Eintritt in die Bakterienzelle aktiviert wird. Zunächst werden frühe und dann späte mRNAs synthetisiert, die in die Ribosomen der Wirtszelle gelangen, wo frühe (DNA-Polymerasen, Nukleasen) und späte (Kapsid- und Schwanzproteine, Enzyme Lysozym, ATPase und Transkriptase) Bakteriophagenproteine ​​synthetisiert werden. Die DNA-Replikation von Bakteriophagen erfolgt nach einem semikonservativen Mechanismus und wird unter Beteiligung seiner eigenen DNA-Polymerasen durchgeführt. Nach der Synthese später Proteine ​​​​und dem Abschluss der DNA-Replikation beginnt der letzte Prozess – die Reifung von Phagenpartikeln oder die Kombination von Phagen-DNA mit dem Hüllprotein und die Bildung reifer infektiöser Phagenpartikel.

Isolierung von Viren in Labortieren.

Die Auswahl der Versuchstiere hängt von der Art des Virus ab. Labortiere sind ein biologisches Modell. Manchmal ist es notwendig, 3-5 „blinde“, asymptomatische Passagen durchzuführen, bevor das Virus an Laborbedingungen angepasst werden kann. Allerdings sind Versuchstiere gegenüber manchen Viren nicht empfindlich, sodass in diesem Fall auf von Natur aus empfängliche Tiere zurückgegriffen werden muss. Wie zum Beispiel bei der Schweinepest und der infektiösen Anämie bei Pferden.

Der Zweck der Infektion von Versuchstieren:

1. Untersuchung der Pathogenese der Krankheit;

2. Isolieren Sie das Virus vom pathogenen Material.

3. Herstellung von Immun- und Hyperimmunseren;

4. Herstellung von Impfstoffen;

5. Aufrechterhaltung von Viren unter Laborbedingungen;

6. Titration, um die Virusmenge pro Volumeneinheit zu bestimmen;

7. Biologisches Modell zur Durchführung der Neutralisationsreaktion;

Die Wahl der Methode zur Infektion von Labortieren hängt vom Tropismus des Virus ab. So wird bei der Kultivierung neurotroper Viren das Gehirn von Tieren infiziert; respiratorisch intranasal, intratracheal; dermatrop – subkutan und intradermal.

Die Infektion erfolgt unter Einhaltung der Regeln der Asepsis und Antiseptika.

Es gibt viele Möglichkeiten, virushaltiges Material in den Körper von Tieren einzubringen:

Subkutan; - intrazerebral; - Intradermal;

Intraperitoneal; - Intramuskulär; - Intraokular;

Intravenös; - Intranasal; - Ernährung;

Nach der Infektion werden die Tiere markiert, in eine isolierte Box gebracht und 10 Tage lang überwacht. Der Tod eines Tieres am ersten Tag nach der Infektion gilt als unspezifisch und wird später nicht berücksichtigt.

3 Anzeichen weisen auf die Wirksamkeit einer Infektion hin:

Vorliegen klinischer Anzeichen

Tod eines Tieres

Pathoanatomische Veränderungen (Größe, Form, Farbe und Konsistenz des Organs).

Ein Hühnerembryo wird befruchtet Ei, in dem sich der Embryo (Embryo) entwickelt. Kultivierung von Viren auf Hühner- und Wachtelembryos in In letzter Zeit hat sich als eine der einfachsten und zuverlässigsten Methoden zur Kultivierung und Diagnose vieler Viren und einiger Bakterien – Brucella, Rickettsia, Vibrio – weit verbreitet.

Viele menschliche und tierische Viren können in sich entwickelnden Hühnerembryonen kultiviert werden. Embryonales Gewebe, insbesondere die Membranen des Embryos, die reich an Keimepithelgewebe sind, sind eine günstige Umgebung für die Vermehrung vieler Viren. Viren mit epitheliotropen Eigenschaften (Pocken, ILT usw.) entwickeln sich erfolgreich auf der Chorioallantoismembran und verursachen makroskopisch sichtbare Veränderungen. Verschiedene Vertreter Myxoviren (Influenza, Newcastle-Krankheit, Staupe usw.), infektiöse Bronchitisviren, Entenhepatitis, Arboviren usw. vermehren sich gut im Embryo, wenn das Material in die Allantoishöhle eingeführt wird. Einige Viren können erfolgreich im Dottersack kultiviert werden.

Vorteile:

1. Wirtschaftlich rentabel, außerdem sind Eier leicht verfügbar;

2. Es gibt keine sich entwickelnden Hühnerembryonen Verteidigungsmechanismus, Weil das Immunsystem ist noch nicht entwickelt;

3. Eierschalen verhindern das Eindringen von Bakterien und Viren aus der Umwelt;

Um Viren auf Hühnerembryonen zu kultivieren und zu isolieren, ist eine sehr einfache Ausrüstung erforderlich – ein normaler Thermostat oder Inkubator.

Bedingungen:

1. Die Eier stammen von nachweislich sicheren Betrieben Infektionskrankheiten;

2. Es ist besser, Hühnerembryonen von weißen Hühnerrassen (Leghorn, Russian White) zu gewinnen, da diese resistenter gegen Manipulationen sind und nicht an leichten Verletzungen sterben. Darüber hinaus ist ihr Panzer weiß und transparenter als der anderer Rassen und lässt sich leichter durchschauen, was zum Betrachten und Beobachten bei der Arbeit mit ihnen praktisch ist.

3. Für die Inkubation werden befruchtete Eier ausgewählt, die vor nicht mehr als 10 Tagen gelegt wurden;

4. Sie nehmen nicht kontaminierte Eier, da diese vor der Inkubation nicht gewaschen werden können und schmutzige Eier bei der Betrachtung (Ovoskopie) weniger sichtbar sind und bei der Arbeit mit ihnen der Embryo während des Manipulationsprozesses infiziert werden kann;

Die Eier werden in einem Inkubator oder in einem Thermostat mit Wassererwärmung und Luftzugang bebrütet. Während der Bebrütung im Thermostat müssen die Eier 2-3 Mal am Tag gewendet und für einen besseren Gasaustausch 5-10 Mal herausgenommen werden Minuten in die Luft. Um eine bestimmte Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, wird ein Gefäß mit Wasser zur Verdunstung in den Thermostat gestellt; die Temperatur im Thermostat sollte 38° betragen.

Die Entwicklung des Embryos erfolgt bereits am ersten Tag der Inkubation, die Verlegung von Gehirn und Skelett erfolgt. Die Struktur eines Hühnerembryos im Alter von 7-9 Tagen(siehe Notizbuch).

Für die Infektion werden am häufigsten Embryonen im Alter von 7 bis 12 Tagen verwendet. Die Arbeit mit Hühnerembryonen wird in einer sterilen Raumbox unter strengster Einhaltung der Asepsis durchgeführt.

Der Zweck der Infektion von Hühnerembryonen ist:

1. Isolieren Sie die Auskleidung vom Lackmaterial;

2. Herstellung von Impfstoffen;

3. Erhaltung des Virus in einem Labor;

4. Titration von Viren;

5. Biologisches Modell zur Durchführung der Neutralisationsreaktion;

6. Untersuchung der Virusinterferenz und der Interferonproduktion; Infektion von Hühnerembryonen:

Für die Infektion müssen lebensfähige Embryonen mit klar definierter Motilität ausgewählt werden. Vor der Infektion werden alle Embryonen in einem abgedunkelten Raum sorgfältig mit einem Ovoskop untersucht.

Beim Durchleuchten von Embryonen vor der Infektion werden mit einem einfachen Bleistift eine Puga (Lufthöhle), der Verlauf großer Blutgefäße und der Präsentationsort des Embryos auf der Schale umrissen, d. h. der Bereich auf der Schale, an dem der Embryo am nächsten liegt Es. Die Markierung des Mopses, der Ort der Präsentation des Embryos und der Verlauf großer Blutgefäße dienen dann als Anhaltspunkt für die Auswahl der Einbringungsstelle des virushaltigen Materials zum Zeitpunkt der Infektion.

Zur Infektion ausgewählte Hühnerembryonen werden in eine Kiste überführt, wo sie bearbeitet werden. Vor der Infektion wird die Schale an der Einbringungsstelle des Materials zweimal mit Jodalkohol behandelt und verbrannt. Die Infektionsdosis beträgt 0,1–0,2 cm.

Je nach Art des Virus und Zweck der Infektion gibt es unterschiedliche Methoden zum Einbringen virushaltigen Materials:

1) Infektion der Chorioallantoismembran , Embryonen im Alter von 7–12 Tagen werden zur Isolierung und Kultivierung neurotroper, dermatroper und einiger pantropischer Viren (Pocken, Enzephalomyelitis, ILT, Maul- und Klauenseuche, Tollwut, Pest usw.) verwendet. Es gibt 3 Infektionsmöglichkeiten:

a) Öffnen Sie die Puga und schneiden Sie sie mit einer Schere ab, trennen Sie die Unterschalenmembran und tragen Sie Material auf die Chorioallantoismembran (CAO) auf. Das Loch im Ei wird dann mit einer sterilen Glaskappe verschlossen und die Ränder der Kappe werden gewachst;

b) Schneiden Sie mit einer Nadelfeile (Feile) oder einem gezahnten Skalpell am Rand der Puja auf der Seite der Präsentation des Embryos ein Dreieck mit einer Seitenlänge von etwa 1 cm in die Schale aus, entfernen Sie den Abschnitt der Schale und Substellare Membran mit einer Pinzette durchbohren und das Material einbringen. Das Loch wird mit einem sterilen Deckglas abgedeckt und die Ränder paraffiniert oder mit einem sterilen Klebeband versiegelt.

c) mit einem Skalpell entfernt kleiner Bereich An der Stelle, an der sich der Embryo präsentiert, wird eine Schale mit einer Fläche von ca. 0,5 cm entnommen, dann wird in diesem Bereich mit einer Pinzette oder einer Nadel die Unterschalenmembran entfernt und das Material injiziert. Wenn das Material nicht gut in den Hohlraum des Eies passt, können Sie mit einem Gummiball die Luft aus dem Ei durch das Loch in der Schale des Eies herauspumpen und so ein künstliches Ei bilden Ort, an dem das Material eingeführt wird, und dann lässt sich das Material leicht einführen. Das Loch in der Schale wird mit einem Heftpflaster abgedeckt oder gewachst.

2) Infektion in der Allantoishöhle. Diese Infektionsmethode ist sehr einfach und dient der Isolierung vieler Viren. Zur Infektion werden 10–11 Tage alte Embryonen entnommen. Es gibt zwei Infektionsmöglichkeiten:

a) Die Infektion erfolgt durch die Puga, ohne sie abzuschneiden. Messen Sie mit einer Nadel den Abstand von der Oberseite des Puga bis zum Rand des Puga, der mit einem Bleistift auf der Schale markiert ist, und führen Sie die Nadel bis zur markierten Tiefe ein und vertiefen Sie sie um weitere 0,5 cm, um die Chorioallantoismembran zu durchstechen;

b) Das Material wird mit einer Nadel durch einen Einstich in der Schale am Ort der Präsentation des Embryos bis zu einer Tiefe von 3–5 mm in einen avaskulären Bereich eingeführt. Das Loch in der Schale wird mit einem Heftpflaster abgedeckt oder gewachst.

3) Infektion im Dottersack. Zur Infektion werden 5-8 Tage alte Embryonen verwendet. Es gibt zwei Infektionsmöglichkeiten:

a) Die Nadel wird unter der Kontrolle eines Ovoskops von der Seite der Puja in einem Winkel von 45° zum Ort der Präsentation des Embryos in den Dottersack eingeführt;

b) Das Ei wird mit der Präsentationsseite des Embryos nach unten auf den Ständer gelegt und die Nadel wird von oben nach unten bis zu einer Tiefe von etwa 1 cm in Richtung des Embryos eingeführt.

Die Injektionsstelle wird mit Klebeband verschlossen und paraffiniert. 4) Infektion in der Fruchthöhle. Bei dieser Infektionsmethode kann das Virus in verschiedene Zellen eindringen und sich dort vermehren, die mit dem Fruchtwasser in Kontakt stehen. Um die Infektion zu erleichtern, wird empfohlen, die Embryonen 2-3 Tage vor der Infektion mit dem Mops nach oben zu inkubieren. Dann bewegen sich Embryo und Amnion nach oben und es ist bequemer, sich zu infizieren. Es gibt zwei Infektionsmöglichkeiten:

a) Die Puga öffnen und abschneiden, die Unterschalenmembran mit einer Pinzette entfernen und das Amnion greifen, das Amnion mit einer Pinzette hochziehen und Material in einer Dosis von 0,1 ml in die Fruchthöhle einführen. Das Loch in der Schale wird dann mit einer sterilen Glaskappe verschlossen und die Ränder werden gewachst;

b) Infektion mit einer langen Nadel durch eine Puga in einem dunklen Raum unter Augenkontrolle. Die Nadelspitze wird zunächst im rechten Winkel gebogen, um einen kleinen Bereich zu erzeugen. Die Nadel wird unter der Kontrolle des Auges durch die Ausstülpung des Präembryos eingeführt; in diesem Fall bewegt sich der Embryo unter dem Druck einer stumpfen Nadel, dann wird das Amnion mit einem leichten Druck durchstochen und die Nadel leicht bewegt Zurückgezogen. In diesem Fall sollte sich der Embryo hinter der Nadel nach oben bewegen. Dann wird das Material eingeführt.

5) Infektion des Körpers des Embryos und Infektion des Gehirns. Es werden 7-12 Tage alte Embryonen verwendet, die Infektion erfolgt durch Einbringen des Materials in verschiedene Körperteile oder direkt ins Gehirn. Zur Infektion wird die Puga geöffnet und der Embryo mit einer Pinzette herausgezogen. Bei diesen Infektionsmethoden können bis zu 30 % oder mehr der infizierten Embryonen an einer Verletzung sterben.

6) Infektion großer Blutgefäße der Chorioallantoismembran. Diese Infektionsmethode wird wie die vorherige sehr selten angewendet. Das Material wird mit einer dünnen Nadel nach Entfernung der Hülle entlang des Blutgefäßes direkt in das Gefäß entlang des Blutflusses injiziert.

Nach der Infektion müssen Hühnerembryonen mit einem einfachen Bleistift markiert und in einen Thermostat gelegt werden. Sie werden täglich durch Sichtung überwacht, die Beobachtung erfolgt je nach Virustyp bis zu 7-8 Tage. Wenn Embryonen sterben, werden sie sofort aus dem Thermostat entfernt und bis zum Öffnen in den Kühlschrank gestellt. Wenn der Embryo innerhalb der ersten 14–18 Stunden stirbt, kann dies an einer Verletzung oder Toxizität des pathologischen Materials liegen. Daher empfiehlt es sich, wie auch bei der Infektion von Versuchstieren, im Zweifelsfall mehrere Passagen durchzuführen und für jedes Material mehrere Embryonen zu entnehmen.

Die Autopsie toter, infizierter oder nach Ablauf der Beobachtungszeit entnommener Hühnerembryonen erfolgt unter Einhaltung aller Regeln der Asepsis unter sterilen Boxbedingungen. Beim Öffnen wird die Schale mit Alkohol behandelt und verbrannt, dann wird die Puga abgeschnitten. Aus dem geöffneten Embryo wird zunächst vorsichtig die Allantoisflüssigkeit abgesaugt (ihre Menge beträgt etwa 7 ml), dann wird die Fruchtwassermembran mit einer Pinzette zurückgezogen, mit einer Pasteurpipette angestochen und das Fruchtwasser abgesaugt (ihre Menge beträgt 1,0- 1,5 ml), dann wird das Eigelb gesammelt, die Membranen entfernt und der Embryo entfernt. Die Flüssigkeit, die Membranen und der Embryo selbst werden sorgfältig auf Veränderungen untersucht. Normalerweise ist das Fruchtwasser völlig klar, bei einer Infektion kann es jedoch trüb und blutig sein. Charakteristische, durch das Virus verursachte Veränderungen sind an der Chorioallantoismembran am stärksten ausgeprägt: Es treten entzündliche Herde auf, die undurchsichtig und rund sind, sowie Blutungen. Am Körper des Embryos können Blutungen auftreten. Das gesamte Material wird in sterilen Behältern gesammelt.

In der Virologie werden Hühnerembryonen häufig nicht nur zur Isolierung von Viren, sondern auch zur Akkumulation und Gewinnung von Antigenen, zur Herstellung von Lebend- und Totimpfstoffen, zur Titrierung von Viren, zur Durchführung einer Virusneutralisierungsreaktion, zur Abschwächung (Abschwächung) von Viren und zur Untersuchung der Interferenz verwendet von Viren und Gewinnung von Interferon.

Isolierung und Kultivierung von Viren

Die Isolierung und Identifizierung des Erregers ist der „Goldstandard“ in der Diagnostik viraler Infektionen.

Zellkultur

Viren vermehren sich nur in lebenden Zellen und die Isolierung des Erregers in einer infizierten Zellkultur ist eine der wichtigsten Methoden zur Diagnose viraler Infektionen. Da sich die meisten pathogenen Viren durch Gewebe- und Typspezifität unterscheiden, ist es möglich, für fast jedes Virus geeignete Zell- oder Gewebekulturen auszuwählen und Standardkultivierungsbedingungen (das Vorhandensein von Zellen desselben Typs) zu schaffen. Die Vermehrung des Virus wird durch empfindliche (permissive) Zellen sichergestellt. Wenn daher ein unbekannter Erreger isoliert wird, werden 3-4 Zellkulturen gleichzeitig infiziert, wobei davon ausgegangen wird, dass eine davon möglicherweise permissiv ist. Zellkulturen werden durch Dispergierung der entsprechenden Organe und Gewebe gewonnen, häufiger werden jedoch embryonale Gewebe (menschlich und tierisch) oder transformierte Tumorzellen verwendet. Wenn Zellkulturen auf einer geeigneten flachen Oberfläche platziert werden, wachsen sie typischerweise als Monoschicht.

Primäre trypsinisierte Kulturen. Zellsuspensionen werden durch Homogenisierung der entsprechenden, mit Trypsin vorbehandelten Gewebe gewonnen. Kulturen werden oft durch Zellen repräsentiert gemischter Typ und kann nicht rekultiviert werden. Die Lebensfähigkeit solcher Pflanzen beträgt 2-3 Wochen.

Halbkontinuierliche Zelllinien dargestellt durch diploide Zellen von Menschen und Tieren. Kulturen eignen sich nur begrenzt für erneute Ausbreitung und Wachstum (in der Regel nicht mehr als 20–30 erneute Aussaaten), behalten aber ihre Lebensfähigkeit bei und unterliegen keiner spontanen Transformation.

Kontinuierliche Zelllinien(heteroploide Kulturen) werden durch Zellen repräsentiert, die einer Langzeitkultivierung und spontanen Transformationen unterzogen wurden. Kulturen sind zur wiederholten Ausbreitung und Transplantation fähig. Die Arbeit mit ihnen ist im Vergleich zur Vorbereitung von Primärkulturen weniger arbeitsintensiv. Die transplantierten Zellen sind in ihrer Morphologie relativ identisch und in ihren Eigenschaften stabil.

Organkulturen

Nicht alle Zelltypen sind in der Lage, als Monoschicht zu wachsen; in manchen Fällen ist die Aufrechterhaltung differenzierter Zellen nur in Organkulturen möglich. Es handelt sich in der Regel um eine Gewebesuspension mit einer speziellen Funktion, die auch als „Gewebe“ bezeichnet wird Kultur des Erlebens von Gewebe.

Hühnerembryonen (Abb. 1-20) - nahezu ideale Modelle für die Kultivierung bestimmter Viren (z. B. Influenza und Masern). Der geschlossene Hohlraum des Embryos verhindert das Eindringen von Mikroorganismen von außen sowie die Entstehung spontaner Virusinfektionen. Embryonen werden zur primären Isolierung von Viren aus pathologischem Material verwendet; zum Passivieren und Konservieren sowie zum Gewinnen benötigte Mengen Virus. Einige Erreger (z. B. Herpesviren) verursachen charakteristische Veränderungen (daran lässt sich die Erkrankung erkennen). Die Infektion erfolgt an der Chorion-Allantois-Membran, in der Amnion- oder Allantoishöhle oder im Dottersack.

Infektion der Chorion-Allantois-Membran. Normalerweise werden 10-12 Tage alte Embryonen verwendet. Die Eier werden im Durchlicht betrachtet, die Lage des Luftsacks wird notiert und ein Bereich ohne Blutgefäße ausgewählt. Entfernen Sie vorsichtig das Schalenfragment, lösen Sie die äußere Schale und ziehen Sie diese mit leichtem Druck ab. Dann wird am Rand des Luftsacks ein Loch gemacht. Beim Absaugen durch dieses Loch wird die Chorion-Allantois-Membran von der Außenmembran abgeschält. Darauf wird das bakterien- und protozoenfreie Testmaterial aufgetragen (durch Bakterienfilter geleitet und mit Bakteriziden behandelt).

Infektion in der Fruchthöhle. Typischerweise werden 7-14 Tage alte Embryonen verwendet, bei denen nach Ablösung der Chorion-Allantois-Membran (siehe oben) die Öffnung erweitert, die Amnionmembran mit einer Pinzette gegriffen und durch die Chorion-Allantois-Membran entfernt wird. Dadurch wird das Testmaterial in die Fruchthöhle eingeführt.

Infektion in der Allantoishöhle. 10 Tage alte Embryonen werden durch Löcher in der Schale und den darunter liegenden Membranen infiziert (siehe oben).

Infektion im Dottersack. Es werden 3-8 Tage alte Embryonen verwendet, bei denen in diesem Alter der Dottersack fast die gesamte Eihöhle einnimmt. Die Infektion erfolgt durch ein Loch im Luftsack

Beobachtung und Aufzeichnung der Ergebnisse. Als virushaltiges Material können Sie den Inhalt des Dottersacks, Allantois- und Fruchtwasser oder den gesamten Embryo, zusammen mit der Umgebung, verwenden

Stoffe in Stücke. Zur Identifizierung von Abb. 1-20.Schematische Darstellung

charakteristische Läsionen am Chorion des sich entwickelnden Hühnerembryos.

Die Schale wird von der Allantoismembran entfernt

und die äußere Hülle. Anschließend wird die Membran entfernt und in steriles Wasser gelegt. Die Art der Läsionen wird vor einem dunklen Hintergrund untersucht.

Tiermodelle

Wenn es nicht möglich ist, das Virus mit Standardmethoden zu isolieren und zu identifizieren in vitro Tieren, die gegenüber dem Erreger empfindlich sind, wird infektiöses Material verabreicht und nach der Entwicklung eines typischen Infektionsprozesses werden empfindliche Zellkulturen erneut infiziert. Am häufigsten werden Mäuse, Kaninchen und Affen verwendet; Um einige Viren (z. B. Coxsackie-Viren) zu isolieren, werden säugende Mäuse infiziert. Aufgrund der hohen Kosten und Komplexität der Labortierhaltung wurden diese fast überall durch Zellkulturen ersetzt. Dennoch werden Tiermodelle aktiv eingesetzt, um die Merkmale der Pathogenese und die Bildung von Immunantworten bei Virusinfektionen zu untersuchen.